鄭州地區正常人群血清炎癥細胞因子參考值范圍測定

蘭 萱，李兆明，張明智

1)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052 2)河南省淋巴瘤國際合作實驗室 鄭州 450052

細胞因子是由免疫細胞(T細胞、B細胞、巨噬細胞等)和一些非免疫細胞(內皮細胞、纖維母細胞)經刺激合成的一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白質，具有調節免疫，促進血細胞生成、細胞生長及損傷組織修復等多種功能。近年來，已有諸多文獻[1-5]報道了細胞因子與多種疾病的關系。細胞因子在血液系統及免疫系統疾病的發病、診斷、藥物療效及預后評價方面也發揮著重要作用。現階段并未見對鄭州地區正常人群炎癥細胞因子水平的大樣本流行病學報道，同時由于臨床報道中正常對照樣本量小、覆蓋范圍窄、地域差異及檢測技術不同，所報道的結果缺乏可比性，所以建立本地區正常人群細胞因子參考值范圍非常重要。流式細胞術微球陣列法(cytometric bead array, CBA)是基于流式細胞儀器檢測平臺的液相蛋白定量技術，具有快速靈敏、重復性高、樣本需求量小的特點，可一次檢測多種可溶性蛋白，在細胞因子多水平同步定量檢測中表現出巨大的優勢。本研究首次采用CBA檢測鄭州地區100名正常人血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A水平，為確定鄭州地區這些因子的正常參考值提供依據，同時也為后續血液及免疫系統疾病的研究奠定基礎。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇經鄭州大學第一附屬醫院體檢中心認定的健康，16～77歲，無急、慢性疾病及傳染病，無特殊元素接觸史的100名受檢者作為研究對象。男性44人，女性56人；根據年齡(按周歲計)分為青年組(17～30歲)35人、中年組(31～45歲)29人、中老年組(46～60歲)32人、老年組(61～77歲)4人。

1.2試驗設備及試劑FACS CantoTM型流式細胞儀和人Th1/Th2/Th17 CBA檢測試劑盒均為美國BD公司產品。

1.3檢測方法①樣品預處理：使用EDTAK血常規抗凝管采集100名受檢者清晨空腹靜脈血2 mL。為避免血清中細胞因子分解消耗，要求2 h內處理血標本。1 800 r/min、4 ℃離心10 min，取100 μL上清，分裝至1.5 mL EP管中，置于-20 ℃冰箱備用，剩余血清標記后置-80 ℃冰箱保存，以備后期再次檢測。②標準品制備：使用分析稀釋液溶解標準品，輕柔混勻后靜置15 min，連續等比例稀釋標準品，得到12,14,18…1256濃度梯度的稀釋標準品。分析稀釋液為陰性對照。③血清及標準品的處理及孵育：按照每個樣本每種捕獲微球10 μL的劑量將7種(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A)捕獲微球懸液混勻，離心(300g，5 min)棄上清后，使用增強緩沖液重懸微球，每50 μL的標準品或待測樣本中加入50 μL捕獲微球混合液，同時加入50 μL PE檢測抗體，室溫條件下避光孵育3 h后，每管用1 mL洗滌緩沖液洗滌，離心棄上清，用300 μL洗滌緩沖液重懸微球，上機檢測各細胞因子水平。④流式細胞儀獲取檢測數據：按相關機型步驟調整并質控流式細胞儀，調試參數后分別檢測標準品及樣品，導出FCS數據文件，用FACP軟件進行分析，繪制標準曲線，精確計算樣品中的細胞因子水平。

1.4數據分析應用SPSS 17.0分析檢測結果。由于各細胞因子血清水平均呈非正態分布，故計算中位數及四分位數間距；采用Wilcoxon秩和檢驗比較不同性別及年齡組間各因子水平的差異；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同性別及年齡分布人群血清各炎癥細胞因子檢測結果比較不同性別及年齡人群7種炎癥細胞因子的水平差異均無統計學意義。見表1、2。

2.2正常人血清各炎癥因子的參考值范圍正常人血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A的參考值范圍分別為2.950～4.697、5.723～12.878、6.970～10.829、4.752～6.504、5.760～12.906、4.332～7.216、7.945～10.910 ng/L。

表1 正常人群中男女血清各炎癥因子比較 ng/L

表中數據為M(P25，P75)

表2 不同年齡段正常人血清各項炎癥因子比較 ng/L

表中數據為M(P25，P75)

3 討論

血清中各種細胞因子均參與機體生理功能，正常穩定的細胞因子水平是保持人體內環境穩定的重要因素。現階段檢測可溶性因子的常規方法很多，包括Western blot定性檢測及ELISA定量檢測，但ELISA每次只能檢測一種細胞因子，不僅費時費力，而且樣本需求量較大，因此適用范圍局限。CBA利用一系列熒光強度不同的微球，上面包被特異性捕獲抗體，其與待測樣本孵育后形成“三明治”復合體，根據軟件計算的標準曲線對目的蛋白進行精確定量，操作方便，操作誤差小，且樣本用量少，一次可進行多種指標檢測。本次研究采用CBA對7種炎癥細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A)水平進行測定，成功建立了穩定的CBA檢測炎癥細胞因子體系，為以后深入研究血液細胞因子網絡動態變化，探求其在淋巴瘤等疾病的發病機制，診斷監測及治療預后中的意義提供了堅實的實驗及數據基礎。

本研究結果中正常人群血清IFN-γ及IL-10水平與山西地區一項研究[6]的報道結果相接近，而其他因子結果之間差異較大，考慮可能與生活環境，飲食習慣等地理因素有關，同時此報道只納入18名正常對照，樣本量較小可能對結果也存在影響。在相關研究中，分別有兩篇[7-8]報道兒童群體中炎癥細胞因子水平，本研究數據與他們的研究結果存在較大差別，兒童炎癥細胞因子水平明顯低于成人，因此對于兒童細胞因子的正常參考值仍需進一步搜集大樣本檢測。此外，兩篇文獻之間的數據也存在差別，分析原因除了地域差異、樣本量小、處理標本誤差外，細胞因子在體內含量較低，因此檢測過程中可能存在多種因素導致各報道中的正常對照結果相差較大。

根據多篇報道正常對照組細胞因子水平不一致可知，正常人群細胞因子水平受多種因素影響，因此單純用外省正常值來衡量鄭州地區顯然是不科學的，所得結論也是不可靠的，因此建立本地區正常人群血清炎癥細胞因子參考值范圍對深入研究正常機體乃至多種相關疾病與細胞因子的關系意義重大。本次研究表明，正常人群中血清細胞因子水平不受性別及年齡影響，但由于本實驗納入人數有限，結果并不能完全反映年齡及性別因素對正常人群血清炎癥細胞因子的影響，還需更加深入廣泛的流行病學調查。

此外,機體內細胞因子水平會對免疫應答、血細胞生成、組織損傷修復等起重要作用，而正常人群的炎癥細胞因子水平受多種因素影響。所以建議平常生活中應注意培養合理的生活習慣，科學飲食搭配，注意加強體育鍛煉增強體質，提高免疫功能，從而使機體血清細胞因子處于合理平衡狀態。

[1] 馮毅.噻托溴銨對COPD穩定期患者炎癥因子和肺功能的影響[J].臨床和實驗醫學雜志,2015,8(8):633

[2] 蔡偉,張秀偉,張希龍,等.阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、炎癥因子與動脈粥樣硬化間關系的研究進展[J].東南大學學報(醫學版),2015,1(1):159

[3] 陳英,張文玲,黃濤,等.炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-17與類風濕關節炎并發動脈粥樣硬化的關系[J].免疫學雜志,2017,3(3):268

[4] 王少鑫,浦江,劉超群,等.炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-4在潰瘍性結腸炎中的表達及臨床意義[J].胃腸病學和肝病學雜志,2015,1(1):104

[5] 徐彥立.聯合血液凈化治療對重癥急性胰腺炎患者炎癥因子和療效的影響[J].重慶醫學,2015,18(18):2553

[6] 陳俊偉,張少然,閆成蘭,等.T輔助細胞亞型細胞相關因子在類風濕關節炎發病中的作用[J].中國藥物與臨床,2012,12(4):420

[7] 徐曉軍,湯永民,趙寧,等.Th1/Th2細胞因子譜在兒童噬血細胞綜合征診斷中的意義[J].中華兒科雜志,2011,49(9):685

[8] TANG Y,XU X,SONG H,et al.Early diagnostic and prognostic significance of a specific Th1/Th2 cytokine pattern in children with haemophagocytic syndrome[J].Br J Haematol,2008,143(1):84