沉默單羧酸轉運體4對宮頸癌Hela、Siha細胞增殖、侵襲遷移及凋亡的影響

郭振江，劉宗文，鄭瑞鋒，宋 銳，張 艷，楚阿蘭，柴 婷，劉耀河，侯 歌，尚豐闊

1)鄭州大學第二附屬醫院放射治療科 鄭州 450014 2)武警河南省總隊醫院腫瘤血液科 鄭州 450052 3)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001 4)中國人民解放軍69223部隊 新疆阿克蘇 842300

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在亞洲人群中發病率非常高，日益成為威脅女性生命健康的嚴重問題[1]。宮頸癌致死的主要原因是部分患者在確診時已經達到晚期，并且在治療過程中對放療、化療產生耐受和抵抗，甚至產生轉移，因此亟需尋找一種新的治療方法。腫瘤細胞對于葡萄糖的利用優先選擇有氧糖酵解的方式進行代謝，產生大量的乳酸[2]；另外，腫瘤細胞異常利用谷氨酰胺也會導致乳酸的生成增加[3]。為避免酸中毒，腫瘤細胞通過膜蛋白將乳酸外排入其微環境，造成微環境的酸化，而這將促進腫瘤多種惡性生物學行為的產生，包括組織侵襲、轉移、新生血管的生成[4]，并抑制宿主局部抗癌免疫力[5]。已經有越來越多的證據表明靶向腫瘤能量代謝重編程可以為腫瘤提供一種有效的治療方法[6-9]。單羧酸轉運體(monocarboxylate transports，MCTs)家族包括了參與乳酸和其他單羧酸鹽轉運的質膜蛋白[10]，通常認為乳酸/H+的細胞外流主要由MCT4介導[11]。MCT4的表達與細胞高度糖酵解有關，腫瘤中MCT4的高表達與多種類型腫瘤的不良預后相關[12]，包括宮頸癌[13]；越來越多的研究[14-16]表明抑制MCT4的表達或功能可以抑制腫瘤的生長。本研究擬通過特異性沉默宮頸癌Hela、Siha細胞中MCT4的表達，研究其對細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料與主要試劑人宮頸癌腺癌細胞系Hela和人宮頸癌鱗癌細胞系Siha(鄭州大學第二附屬醫院消化研究所饋贈)。DMEM高糖培養基(HyClone公司)，胎牛血清(BI公司)，RIPA蛋白質裂解液(強)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，鼠抗人單抗MCT4(Santa Cruz公司)，兔抗人β-actin多克隆抗體、羊抗兔二抗(Proteintech公司)，siRNA(上海生工生物工程有限公司)，Opti-MEM(Gibco公司)，Matrigel 基質膠(BD公司)，Transwell小室(Corning公司)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，乳酸定量試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2細胞培養與siRNA轉染人宮頸癌細胞Hela、Siha在含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養基上于37 ℃、含體積分數5% CO2的條件下培養。取對數生長期的細胞進行實驗。將細胞分為4組，分別為空白對照組(Ctrl組)、陰性對照組(siNC組)、實驗組1(siMCT4#1組)和實驗組2(siMCT4#2組)，每組均設3個復孔。將細胞以2 ×105個/mL的密度接種于6 孔板內，常規條件下培養。待細胞生長接近50%～60%融合時參照Lipofectmine 3000試劑盒說明書進行siRNA轉染，將siRNA(siNC、siMCT4#1和siMCT4#2)及脂質體Lipofectamine 3000分別用無血清Opi-MEM培養基稀釋，室溫靜置5 min，再分別將上述稀釋后的siRNA和稀釋后的Lipofectmine 3000混合均勻，室溫孵育20 min 后轉移至6 孔板中，并用無血清的Opi-MEM補充至每孔2 mL，使siMCT4#1、siMCT4#2終濃度都為100 nmol/L。在轉染后不同時間點根據實驗需要分別進行相關指標的檢測(siRNA序列見表1)。

表1 特異性siRNA序列

1.3Westernblot檢測siRNA的沉默效果轉染96 h后加入RIPA 蛋白裂解液抽提蛋白，BCA法進行蛋白定量，按照凝膠試劑盒說明配制分離膠及濃縮膠并上樣。濃縮膠中以90 V恒壓電泳至分離膠后改為恒壓120 V電泳直至溴酚藍跑至凝膠底部。轉膜后以恒流300 mA電轉60～100 min。取出PVDF膜，置于50 g/L脫脂奶粉液中室溫封閉2 h。抗體孵育：將PVDF膜封入含一抗(MCT4，按1200稀釋；β-actin，按11 000稀釋)的雜交袋中，4 ℃過夜。取出后室溫復溫30 min，用含吐溫的TBST洗膜30 min，再加入羊抗兔二抗(按110 000稀釋)，室溫充分孵育2 h，TBST搖洗30 min。加入ECL化學發光液，于全自動凝膠成像儀下曝光。用Image J軟件對圖像進行灰度值分析，計算MCT4/β-actin灰度比值。

1.4乳酸試劑盒檢測Hela、Siha細胞外基質中乳酸含量細胞轉染培養96 h后，按1.2分組將各組中的培養液轉移至EP管中，根據乳酸定量試劑盒步驟測定乳酸含量。用酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad公司，美國)在530 nm波長處分別測定各管中液體的吸光度(A值)，然后按照試劑盒內公式計算出各組培養液中的乳酸含量。

1.5CCK-8檢測Hela、Siha細胞的增殖情況分別于轉染后24、48、72和96 h檢測Hela、Siha細胞的增殖情況。于超凈臺環境內每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃避光溫育2 h，于450 nm波長下應用酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)測定各孔A值。

1.6劃痕實驗檢測Hela、Siha細胞的遷移率轉染后96 h于顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，如貼壁良好且鋪滿皿底，用槍頭垂至于皿底的水平橫向劃5條線。用PBS輕柔漂洗細胞3次，去除漂浮的細胞，加入無血清的DMEM培養液，放入37℃、體積分數5%CO2培養箱培養。在劃痕實驗開始24 h之內，選取固定視野拍照分析并計算遷移率，遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.7Transwell實驗檢測Hela、Siha細胞的侵襲性

在Transwell 小室上層中鋪70 μL 稀釋后的Matrigel膠(Matrige膠DMEM=16)，37 ℃孵育過夜，之后加入70 μL DMEM 無血清培養基并在37 ℃孵育箱中活化1 h。取經轉染處理96 h的Hela、Siha細胞，配制成1×106個/mL的細胞懸液，每個小室中加100 μL 細胞懸液，均勻地鋪于Transwell小室中，下層加600 μL 含體積分數20% FBS的完全培養基，37 ℃孵箱培養24 h，取出Transwell 小室，用棉簽輕輕地拭去小室上層的細胞，PBS 洗2 遍，每孔中加入500 μL甲醇浸泡小室30 min，最后用結晶紫染色30 min，分別用PBS漂洗2遍[17]。在倒置顯微鏡下選取5 個視野拍照，用酶聯免疫檢測儀檢測A值。

1.8流式細胞術檢測Hela、Siha細胞的凋亡率轉染96 h 后用無EDTA的胰蛋白酶消化細胞，并用完全培養基混懸細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5min，收集細胞，加入500 μL的Binding Buffer，輕柔吹打，重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后，孵育15 min，之后加入5 μL碘化丙啶(PI)，混勻后避光、室溫孵育5～15 min，于1 h內用流式細胞儀檢測，用BD Accuri C6軟件分析結果。

1.9統計學處理采用SPSS 21.0進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組Hela、Siha細胞外液中乳酸濃度、細胞增殖、遷移能力、侵襲能力和凋亡的變化，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1Westernblot檢測siRNA的沉默效果見圖1、表2。與Ctrl組相比，沉默MCT4 96 h后，siMCT4#1組和siMCT4#2組Hela、Siha細胞中MCT4蛋白表達含量均下降，差異有統計學意義(P<0.001)。由表2可知，siMCT4#2沉默Hela、Siha細胞中的MCT4效果更好，因此選用siMCT4#2進行后續實驗。

1：Ctrl組；2：siNC組；3：siMCT4#1組:4：siMCT4#2組圖1 各組Hela(上)、Siha(下)細胞中MCT4蛋白的表達

表2 各組Hela、Siha細胞中MCT4蛋白表達的比較(n=3)

*：與Ctrl組相比，P<0.05；▲：與siNC組相比，P<0.05；△：與siMCT4#1組相比，P<0.05

2.2沉默MCT4對宮頸癌細胞外乳酸濃度的影響

見表3。

表3 各組Hela、Siha細胞外液中乳酸濃度的變化(n=3) mmol/L

*：與Ctrl組相比，P<0.05；△：與siNC組相比，P<0.05

2.3沉默MCT4對宮頸癌細胞增殖的影響見圖2。由圖2可知，沉默MCT4后，Hela、Siha細胞增殖受到抑制的效果一直持續到96 h。

圖2 沉默MCT4對宮頸癌Hela(上)、Siha(下)細胞增殖的影響

2.4沉默MCT4對宮頸癌細胞遷移能力的影響見圖3、表4。

1：Ctrl組；2：siNC組；3：siMCT4#2組圖3 沉默MCT4對宮頸癌Hela(上)、Siha(下)細胞遷移能力的影響

表4 各組Hela、Siha細胞遷移率的變化(n=3)

*：與Ctrl組相比，P<0.05；△：與siNC組相比，P<0.05

2.5沉默MCT4對細胞侵襲能力的影響見圖4、表5。

1：Ctrl組；2：siNC組；3：siMCT4#2組圖4 沉默MCT4對宮頸癌Hela(上)、Siha(下)細胞侵襲能力的影響

表5 各組Hela、Siha細胞相對侵襲率的變化(n=3)

*：與Ctrl組相比，P<0.05；△：與siNC組相比，P<0.05

2.6沉默MCT4對宮頸癌細胞凋亡的影響見表6。流式細胞術檢測結果顯示沉默MCT4基因可以促進Hela和Siha細胞的早期凋亡。

表6 各組Hela、Siha細胞凋亡率的變化(n=3) %

*：與Ctrl組相比，P<0.05；△：與siNC組相比，P<0.05

3 討論

大多數腫瘤依靠高速有氧糖酵解的方式產能，這將導致細胞內大量的乳酸生成，為了防止細胞酸中毒和保證細胞糖酵解的高速進行，腫瘤細胞將大量乳酸排到胞外[4,6,9]。外排的乳酸導致腫瘤酸性微環境的形成，從而為腫瘤增殖、侵襲、轉移、局部免疫抑制以及一些化療藥物抵抗創造了條件[5-8]。在負責乳酸外排的胞膜蛋白中，MCT4發揮著重要的作用。MCT4是單羧酸轉運體家族中的重要一員，主要存在于進行糖酵解的組織和一些腫瘤細胞中，作用就是將細胞內產生的大量乳酸排到胞外，調節細胞內外的pH值[11]。已有研究[14-16]發現，MCT4在多種惡性腫瘤(如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌)中表達，并且和多種惡性腫瘤的不良預后相關。Pinheiro等[13]報道，在宮頸鱗癌和腺癌組織中均存在MCT1 和MCT4的高表達，并且MCT1 和MCT4 在CD147 陽性病例中更富于表達；此外，CD147 和MCT1 的共表達與宮頸腺癌的淋巴結轉移和遠處轉移相關。還有研究[18]發現，與人類乳頭瘤病毒(HPV)陰性侵襲性宮頸癌組織相比，HPV 陽性宮頸癌病變中MCT1 和MCT4 的表達更多見。

已經有越來越多的研究[14-16]表明，通過siRNA特異性沉默MCT4可以抑制腫瘤細胞的侵襲遷移等惡性行為的產生，提示MCT4可以作為潛在的治療靶點。基于MCT4在Hela和Siha細胞中的表達，本研究通過轉染siRNA特異性沉默Hela和Siha細胞中的MCT4基因，結果表明下調MCT4蛋白可以顯著地抑制Hela和Siha細胞的增殖，表明特異序列的siRNA可作為潛在的治療藥物。本研究結果顯示，下調MCT4表達后，可有效地抑制Hela和Siha細胞的遷移和侵襲能力。流式細胞術檢測結果顯示：轉染96 h 后實驗組細胞的早期凋亡率高于空白對照組和陰性對照組，表明可以通過抑制乳酸的外排來干擾細胞內葡萄糖有氧糖酵解的代謝通路，誘導其發生凋亡。

但MCT4下調后抑制Hela和Siha增殖、遷移和侵襲以及其他腫瘤生物學行為的機制需要進一步研究。作者認為可以使用FDG-PET作為代謝示蹤劑，以確定宮頸癌細胞在體內受到MCT4治療之后葡萄糖的攝取是否受到影響[14]；或者使用穩定的同位素標記的代謝物，如13C-葡萄糖，用于更全面地評估沉默MCT4后葡萄糖代謝的指標變化情況[19-20]。另外，也可以考慮與目前常用于治療宮頸癌的化療藥相結合來提高療效，或者與其他葡萄糖代謝調節劑(如二甲雙胍[21]或線粒體抑制劑)聯合來更完全地封鎖腫瘤細胞對葡萄糖的利用。

綜上所述，特異性沉默MCT4基因可抑制Hela、Siha細胞的增殖、遷移和侵襲，并且促進其凋亡的發生，提示MCT4可作為宮頸癌潛在的治療靶點。

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