一顯性營養不良型大皰性表皮松懈癥家系COL7A1基因突變分析

黃艷梅， 董雙雙，曹靚磊，郭利偉，張詠鶴，李 茜，楊保勝

新鄉醫學院法醫學院法醫物證學教研室 河南新鄉 453003

營養不良型大皰性表皮松懈癥(dystrophic epidermolysis bullosa，DEB)是一種遺傳異質性皮膚病，臨床特征主要表現為皮膚黏膜對機械性損害易感并形成大皰，遺傳方式以常染色體顯性或隱性遺傳。目前認為DEB的發病機制與編碼基底膜下帶錨原纖維的主要成分——Ⅶ型膠原的COL7A1基因突變有關，且具有遺傳異質性[1-2]。本研究對一常染色體顯性遺傳DEB家系的COL7A1基因突變進行了分析，并對其發病的分子基礎與臨床表型之間的關系進行探討。

1 對象與方法

1.1研究對象此家系為河南漢族人，無近親結婚史，家系三代中，每一代均有患者，根據系譜圖(圖1)分析符合常染色體顯性遺傳。先證者男(Ⅲ1)，2歲，出生后不久受到輕微外傷或摩擦后出現水皰、糜爛及破潰，主要集中在脛前、踝和上肢伸肌側，愈后留有萎縮性瘢痕和粟丘疹，輕度瘙癢并且伴有指(趾)甲萎縮，甚至脫落。病情隨年齡增長逐漸減輕。家系中其他患者均在出生或出生后不久輕度外傷后發生大皰性損害，愈后留有色素改變、粟丘疹及萎縮性瘢痕。成年后上述癥狀減輕，四肢伸肌側形成苔蘚樣斑塊及條索樣改變。所有患者手、足甲板均有不同程度的增厚變形，均無黏膜和毛發改變。結合臨床、組織病理學和電鏡觀察結果，確診此家系為常染色體顯性遺傳型DEB。

箭頭所指為先證者圖1 DEB家系圖

1.2全基因組DNA的提取在知情同意情況下，采集該家系成員10人外周靜脈血各5 mL， 另取50名健康人外周靜脈血作為對照。20 g/L EDTA 抗凝，然后采用有機酚-氯仿法提取血樣基因DNA。

1.3PCR擴增及測序參照文獻[3-4]合成72對引物，對COL7A1基因的118個外顯子、內含子全部進行擴增并測序。其中13號外顯子的引物序列為：正義5’-CCTTCTCACTCTGCGTCCCT-3’，反義5’-AACCAGGACCAGAGTGAGGC-3’； 63號外顯子的引物序列為：正義5’-CTCCCAAAGTCCTTGAAATC-3’，反義5’-AGAACTATGAAGCCCAGCAC-3’；64號外顯子的引物序列為：正義5’- AGTGGTTGGGTGCT GGGCTT-3’，反義5’-CACGTTCGCCCTGATGGAAA-3’；73號外顯子的引物序列為：正義5’-GGGTG TAGCTGTACAGCCAC-3’，反義5’-CCCTCTTCCCT CACTCTCCT-3’ 。 PCR擴增體系為25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；94℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸45 s，共33個循環；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。擴增后經60 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，由美國Life Technology公司[英濰捷基(上海)貿易公司]進行雙向測序。分析測序結果并與健康人及GenBank數據庫中序列進行比較。

1.4新突變的致病性鑒定通過與NCBI dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、HGMD數據庫(http://www.hgmd. cf.ac.uk /ac/all.php)和近5 a文獻進行檢索，證實檢測到的突變是否為新發突變；利用Clustal X軟件，對人、小家鼠、褐家鼠、牛、黑猩猩、獼猴、非洲爪蟾、斑馬魚等10個物種該位點的氨基酸進行保守性分析，根據保守性的強弱來判斷突變致病性的大??；利用SIFT、Mutationtaster和PolyPhen軟件對突變的危害性進行預測，以此判斷突變的致病性。

2 結果

2.1PCR擴增結果所有72對引物在各自的條件下分別擴增各自的產物，包括所有118個外顯子的編碼序列以及側翼內含子序列。PCR擴增產物所擴增的所有外顯子通過凝膠電泳檢測顯示片段長度與預期的一致。

2.2分子遺傳學檢測結果對該DEB家系所有成員的COL7A1基因進行了基因測序，突變測序結果與50名健康人及GenBank 數據庫(http://www. ncbi. nlm.nih. gov/genbank)進行對比分析，共篩選出5個突變位點，其中包括1個錯義突變、3個同義突變和1個插入突變。見表1、圖2。該家系中患者(Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1)均出現了這些突變，且均表現為雜合子。除此之外，先證者Ⅲ1第13號外顯子存在c.1731_1732insA插入突變，導致了提前終止密碼(PTC)的產生。在作為對照的50名健康人以及該家系表現正常者中未檢測到上述突變。

表1 顯性遺傳型DEB COL7A1基因突變位點

2.3新突變的致病性鑒定

2.3.1 突變位點氨基酸的保守性分析結果 COL7A1肽鏈即α3鏈第2 006位氨基酸(即突變所在位置)在10個不同來源的跨物種中均為甘氨酸，說明該位點在進化過程中高度保守，該位點一旦發生突變，勢必影響COL7A1蛋白的氨基酸組成，影響其螺旋結構，進而影響其正常功能。由此可以推斷，本研究檢測到的p.G2006S突變可能是致病性突變。

A：患者第1 641位堿基發生G→T突變，導致第547位色氨酸(TGG)突變為亮氨酸(TTG)，即W547L；B：患者第5 451位堿基發生A→G 突變，導致第1 817位谷氨酰胺由(CAA)突變為(CAG)；C：患者第5 508位堿基發生G→C突變，導致第1 836位甘氨酸由(GGG)突變為(GGC)；D：患者第6 016位堿基發生G→A 突變，導致第2 006位甘氨酸(GGC)突變為絲氨酸(AGC)，即G2006S ； E：先證者第1 731和第1 732位堿基之間插入了一個A堿基，導致PTC的產生，即c.1731_1732insA 圖2 COL7A1基因測序結果

2.3.2 新發突變致病性的預測結果 Mutationtaster軟件對插入突變c.1731_1732insA的預測結果為“可能影響蛋白質功能”；PolyPhen軟件對錯義突變p.G2006S的預測結果為“很可能致病”， Mutationtaster和SIFT軟件預測結果為“可能影響蛋白質功能”，可見p. G2006S位的甘氨酸被絲氨酸替代是有害的，進一步證實錯義突變p.G2006S突變可能是一種致病性突變。

3 討論

DEB是一種少見的遺傳性皮膚病，按其遺傳形式可分為常染色體隱性和顯性遺傳[5-6]。DEB的發生與編碼Ⅶ型膠原蛋白的COL7A1 基因突變有關。目前已知COL7A1 基因定位于人3p21.3區域，長度為23 000 bp[7]。 COL7A1基因在維持真表皮連接結構穩定性中具有非常重要的作用，它的突變會導致Ⅶ型膠原數量減少或形態異常，使得皮膚基底膜致密板下的錨原纖維(其主要成分是Ⅶ型膠原)不能維持正常的功能。皮膚在機械性外傷或表皮摩擦時，易發生表皮與真皮的分離，形成大皰[8-10]。COL7A1突變有多種。其中，位于三螺旋區的甘氨酸替代突變為DEB最常見的基因突變類型。由于Ⅶ型膠原中心三螺旋區的結構特征是Gly-Xaa-Yaa連續重復，膠原區Gly-Xaa-Yaa結構中甘氨酸是最小的氨基酸，對于膠原蛋白的結構和功能至關重要[11-12]，當甘氨酸被其他種類的氨基酸替代后，影響Ⅶ型膠原的聚集，導致錨原纖維的改變，導致DEB的發生。

本研究發現了一個尚未見報道的插入突變c.1731_1732insA，即在COL7A1基因的第13號外顯子上插入了一個A堿基，導致第13號外顯子發生移碼突變。本研究發現該突變造成編碼區閱讀框架的移位，產生提前終止密碼(PTC)，導致肽鏈合成提前終止，最終產生無意義的蛋白質[4]。該突變僅出現于先證者(Ⅲ1)COL7A1基因上，先證者在該家系患者中病情最嚴重，此突變是否與DEB臨床表型有關還有待于進一步研究。

本研究亦發現了1個錯義突變即c.6016G→A (p.G2006S)。該家系患者均出現此突變，表現為雜合子。先證者母親(Ⅱ2)無DEB臨床癥狀，基因檢測結果未發現異常，50名健康人未檢測到此突變，推測上述突變為該家系的致病突變位點。錯義突變G2006S國外已被Mallipeddi等報道[13]，但是本文患者病情與Mallipeddi等的報道不甚相同。由此可見，即使同一突變，在不同家系中可能表現為不同的表型，甚至在同一家系具有相同基因突變的成員臨床表現也可能有較大差異。除此之外，作者在該家系的所有患者中還檢測到了3個尚未報道的同義突變，分別為c.1641G→T、c.5451A→G和c.5508G→C。同義突變可能使原先的密碼子變成稀有密碼子，導致多肽鏈合成速率的改變進而影響蛋白折疊及構象，但其與DEB表型之間的關系還需要進一步研究。

同時，用Clustal X軟件對p.G2006S突變位點氨基酸保守性分析結果顯示該位點在進化過程中高度保守。PolyPhen等軟件對p.G2006S突變預測結果顯示此突變很可能為致病突變；Mutationtaster等軟件對c.1731_1732insA突變預測結果顯示上述突變可能導致DNA剪接位點、氨基酸序列和蛋白質結構的改變，進一步證實了本研究發現的p.G2006S和c.1731_1732insA突變可能是DEB的致病性突變。

COL7A1基因突變在營養不良性大皰性表皮松懈癥中被發現致病的首次報道是在1993年，至2015年3月，人類基因突變數據庫報告了700余種基因突變[3,14]。然而如此眾多的COL7A1基因突變點所導致的生物學后果也極其復雜[15-17]，即基因型-臨床表型關系的研究仍處于初始階段[18-19]。本研究發現了4個尚未見報道過的COL7A1基因突變位點，進一步豐富了COL7A1基因突變數據庫，更可為將來開展產前診斷、基因治療打下基礎。

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