上皮性卵巢癌組織中Slug和E-cadherin的表達

孫 瑋，李紅雨，臧星卉，魚志琪，劉 端

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052

卵巢癌是女性生殖器官最常見的三大惡性腫瘤之一，在婦科惡性腫瘤中發病率居第2位，其病死率居首位；由于卵巢位置較深，早期病變不易發現，缺乏特異的早期臨床表現及診斷方法，約70%的卵巢癌患者在發現時已屬晚期，并有廣泛的盆腹腔淋巴結轉移或腹水形成[1-2]，其中約僅有10%不是上皮組織來源的卵巢癌，其他組織學類型均為上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)[3]。目前，臨床上卵巢癌的治療方法主要是手術和放化療，化療耐藥性和術后易復發使卵巢癌患者的5 a生存率徘徊于25%～45%[4]。因此，需要尋找對卵巢癌的早期診斷、臨床治療等方面具有重要價值的特異性高、敏感性強的分子標志物。腫瘤的發生發展和侵襲轉移是一個涉及多基因參與、多個復雜步驟完成的過程，以腫瘤細胞間黏附力減低和運動增強為基礎，這一過程需要憑借于內環境之間的相互作用，其中上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是主要因素之一[5]。目前發現了許多與EMT密切相關的轉錄抑制因子，Slug屬于鋅指結構蛋白超家族，可與靶基因啟動區E-盒結合，被認為是EMT的始動因素[6]。本研究擬通過免疫組化SP法和實時熒光定量PCR法檢測Slug與E-cadherin在不同卵巢組織中蛋白和mRNA的表達情況，探討Slug及E-cadherin在卵巢癌的發生發展、侵襲轉移過程中的作用機制及相互關系。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2015年2月至2017年3月在鄭州大學第三附屬醫院住院并行手術切除卵巢的患者共104例，年齡28～67(48.1±12.7) 歲，其中術后病理確診卵巢上皮性癌54例(卵巢癌組)，卵巢良性上皮性腫瘤30例(良性卵巢組)，正常卵巢20例(正常卵巢組)。卵巢上皮性癌和卵巢良性上皮性腫瘤患者均為初發病例，術前均未行任何放、化療。手術室內取新鮮離體標本分為兩份：一份標本離體后置凍存管，立即放入-80 ℃液氮中保存備用；另一份標本經常規體積分數10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。采用國際婦產科聯盟FIGO(2006)的手術病理分期標準對卵巢上皮性癌進行分期：Ⅰ-Ⅱ期20例，Ⅲ-Ⅳ期34例；采用世界衛生組織(WHO)的卵巢組織學分類(2003年制定)標準進行分類：黏液性癌15例，漿液性癌39例；組織學分級：G1 8例，G2 10例，G3 36例；無淋巴轉移21例，有淋巴轉移33例；無腹水19例，有腹水35例。

1.2主要試劑Slug、E-cadherin兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，辣根氧化酶標記的二抗、DAB顯色劑、枸櫞酸鹽緩沖液、正常山羊血清封閉液及蘇木素染液等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，mRNA反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國GeneCopoeia公司。

1.3卵巢組織中Slug、E-cadherin蛋白表達的免疫組化SP法檢測取經體積分數10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋后的組織標本，連續4 μm厚切片。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。二甲苯常規脫蠟及乙醇水化，雙氧水室溫孵育10 min，滴加正常山羊血清封閉液室溫下封閉30 min，去液體，滴加100倍稀釋的Slug、E-cadherin蛋白一抗，4 ℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次，滴加辣根酶標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS洗5 min×3次，滴加SABC，室溫孵育30 min，PBS洗5 min×4次，DAB顯色劑室溫顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，脫水透明封片。由本院病理科醫師進行顯微鏡下觀察染色結果。結果判定：每張切片挑選5個高倍視野計數染色程度和陽性細胞百分比，Slug蛋白染色陽性的細胞為細胞核或細胞漿被染成棕黃色顆粒；E-cadherin蛋白染色陽性的細胞為細胞膜或細胞漿被染成棕黃色顆粒。①染色程度評分：無色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；②陽性細胞百分比評分標準：<5%為0分，6%～為1分，21%～為2分，>50%為3分。根據細胞染色強度及陽性染色細胞的百分比評分的乘積進行定量評分，評分≥2分為陽性表達。

1.4卵巢組織中Slug和E-cadherinmRNA表達的實時熒光定量PCR檢測剪取約0.1 g卵巢組織放入勻漿器中，加1mL TRIzol試劑，在冰上進行勻漿，提取總RNA，分光光度計測定其純度和濃度合格后-80 ℃保存備用。Slug引物序列：5’-GCAATAAGACCTATTCAAC-3’(上 游)；5’-ATATTC CTTGTCACAGTATT-3’(下游)。E-cadherin引物序列：5’-TAGGTATTGTCTACTACTCTG-3’(上游)，5’-TATATCACTCTTGCTTCA-3’(下游)；GAPDH引物序列：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(上游)，5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(下游)。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72℃延伸 15s，共35～40個循環；采用2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1不同卵巢組織中Slug和E-cadherin蛋白及mRNA的表達見表1和圖1。由表1可知，正常卵巢組、良性腫瘤組與卵巢癌組中的Slug蛋白陽性表達率及mRNA相對表達量依次升高，E-cadherin蛋白陽性表達率及mRNA相對表達量依次降低。卵巢上皮性癌組織中Slug和E-cadherin的mRNA表達呈負相關(r=-0.276，P=0.044)。

表1 不同卵巢組織中Slug和E-cadherin蛋白陽性表達率及mRNA的相對表達量

A：Slug蛋白；B：E-cadherin蛋白；1：上皮性卵巢癌組；2：卵巢良性上皮性腫瘤組；3：正常卵巢組圖1 上皮性卵巢癌組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織中Slug和E-cadherin蛋白的表達(SP，×400)

2.2Slug和E-cadherin蛋白陽性表達率與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征間的關系見表2。

表2 Slug和E-cadherin蛋白陽性表達率與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征間的關系

續表2

3 討論

EMT是指在某些特殊條件下，具有極性的上皮細胞轉化成間質細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程。研究[7-8]發現，腫瘤細胞通過EMT發生上皮細胞標志物(E-cadherin)下調、間質細胞標志物(N-cadherin、波形蛋白等)上調，細胞黏附分子丟失、肌動蛋白重塑，從而獲得轉移和侵襲能力。E-cadherin是鈣黏附蛋白家族中的一種亞型，作為典型的上皮細胞轉移抑制因子，在降低細胞間黏附力方面發揮重要作用[9]。轉錄因子是誘導EMT的始動因素，E-cadherin的表達下調主要通過E-cadherin的轉錄抑制因子與其啟動子的結合而實現，E-cadherin轉錄抑制因子主要包括Zeb家族成員、Snail1、Slug、Twist等[10-11]。

Slug又稱為Snail2，其和Snail1屬于Snail鋅指結構蛋白超家族的轉錄因子， Slug的C-末端附近有結合DNA特異性序列的鋅指結構域，N-端有介導轉錄抑制的SNAG結構域，這些鋅指結構域的特異性序列與DNA作用結合到E-盒的5’-CAGGTG-3’上，從而調節其下游基因的表達(即Slug有E-盒結合位點，與E-cadherin啟動元件E-盒結合，直接抑制E-cadherin的轉錄)[12-13]。本研究通過免疫組化SP法和熒光定量PCR方法檢測發現，正常卵巢組、良性卵巢組與卵巢癌組中的卵巢組織Slug蛋白陽性表達率及mRNA相對表達量依次升高，E-cadherin蛋白陽性表達率及mRNA相對表達量依次降低，差異均有統計學意義，提示Slug及E-cadherin可能參與了卵巢癌的發生發展。進一步分析發現，在上皮性卵巢癌組織中Slug蛋白的陽性表達率隨FIGO分期增加而升高，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組，有腹水組高于無腹水組，而E-cadherin的蛋白表達陽性率與之相反，提示Slug高表達和E-cadherin低表達在卵巢癌的侵襲轉移過程中發揮重要作用，可作為判斷卵巢癌惡性程度、生物學行為和預后的參考指標，與岳銀艷等[14]報道一致。

本研究相關性分析顯示，在卵巢上皮性癌組織中Slug和E-cadherin的mRNA相對表達量呈負相關，提示Slug和E-cadherin在卵巢癌的發生發展和轉移的過程中可能存在相互調節的機制，共同參與卵巢癌的發生發展。

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