高黏液型肺炎克雷伯菌莢膜血清分型及碳青霉烯類耐藥機制研究

杜芳玲， 梅艷芳， 萬臘根， 魏丹丹， 張 偉， 向天新， 劉 洋

肺炎克雷伯菌是醫院感染和社區獲得性感染的重要病原體，其可造成肺部感染、尿路感染、軟組織感染及血流感染等多種感染[1]。高黏液表型肺炎克雷伯菌（HMKP）一直作為高毒力肺炎克雷伯菌的重要特征而被廣泛關注[2]。自20世紀80年代首次從肝膿腫患者中分離到碳青霉烯類耐藥-HMKP（CR-HMKP）以來，因其可發生遷徙性播散感染，已經成為了一個威脅全球公共健康問題的病原體[3]。HMKP常在瓊脂平皿上表現出高黏液表型，常與rmpA、氣桿菌素等多種毒力基因相關[3]。越來越多的研究表明HMKP表現耐藥給臨床治療帶來了嚴峻的挑戰[4]。一直以來，碳青霉烯類抗生素作為抗擊革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線，但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用以及質粒介導的碳青霉烯酶的流行，導致CR-HMKP逐漸在全球范圍內被報道[5]。雖然Zhan等[6]首次闡述了溫州地區ST11型CR-HMKP菌株的暴發流行，但對其產生原因及莢膜血清分型等方面的內容未作深入的分析。本研究主要通過對CR-HMKP的篩選，分析CR-HMKP的莢膜血清分型及毒力基因攜帶，并對細菌對碳青霉烯類耐藥機制可能產生的原因進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集南昌大學第一附屬醫院2012－2016年碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌675株，其中CR-HMKP 18株（2.7%）。所有菌株采用VITEK 2-Compact 全自動微生物鑒定儀進行鑒定。

1.1.2 主要儀器和試劑 ExTaq酶和DNA Marker購自大連TaKaRa公司；VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀（法國生物梅里埃有限公司）、 PCR儀及電泳儀（美國Bio-Rad公司）、凝膠成像儀（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物敏感性試驗及表型試驗 抗菌藥物敏感性試驗采用VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統，結果根據2016年美國CLSI標準進行判斷。用改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM）方法初步篩查碳青霉烯酶[7]。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603（由本實驗室保存），疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53為接合試驗受體菌。

1.2.2 拉絲試驗 將受試肺炎克雷伯菌菌株接種于5%羊血瓊脂平皿，于37℃孵育過夜，用細菌接種環輕柔向上挑起菌落，如不能挑起黏液絲或黏液絲長度小于5 mm，判為黏液絲試驗陰性；如挑起的黏液絲長度大于或等于5 mm，判為黏液絲試驗陽性。

1.2.3 耐藥基因及毒力基因的檢測 參照文獻 [5，8-9]，采用PCR法檢測所有碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48）、ESBL基因（blaTEM、blaSHV、blaCTX-M）、質粒介導喹諾酮耐藥（PMQR）基因（qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、acc(6')-Ib-cr）、16S rRNA甲基化酶基因（rmtB、rmtC、armA、armB）、毒力基因（aerobactin、iroN、magA、rmpA、rmpA2、alls、mrkD）。陽性擴增產物回收后由上海生物工程公司完成測序，與GenBank序列進行比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）.

1.2.4 質粒接合試驗 臨床分離的CR-HMKP作為供體菌，大腸埃希菌J53為受體菌。供體菌和受體菌接種中國藍平皿，37 ℃孵育過夜。挑取單個菌落接種至5 mL營養肉湯中，37℃搖床孵育4 h。取供體菌菌液10 μL和受體菌菌液20 μL混合，接種于4 mL LB肉湯，35℃孵育18 h。吸取100 μL上述過夜培養的混合菌液均勻涂布到篩選平皿（0.5 mg/ L亞胺培南+200 mg/L疊氮鈉），37℃孵育過夜。挑取篩選平皿上的單菌落轉至另一個篩選平皿，37℃孵育過夜，對轉移接合子采用VITEK 2-Compact 全自動微生物鑒定儀進行生化鑒定和藥敏試驗，對接合子做mCIM試驗以篩查是否產碳青霉烯酶，并通過PCR及測序予以證實。

1.2.5 莢膜血清分型 參照文獻 [8]，采用PCR檢測K1、K2、K5、K20、K54、K57等常見莢膜血清分型，對PCR擴增產物進行測序后BLAST比對確認；同時采用PCR方法擴增肺炎克雷伯菌的wzi基因[10]并測序，再與數據庫比對，分析菌株的wzi分型（http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）。

1.2.6 脈沖場凝膠電泳（PFGE） 取單個細菌菌落接種于LB培養基中，震蕩過夜。用菌液與低熔點膠混勻后灌模，蛋白酶K消化4 h，TE緩沖液清洗后使用Xba I內切酶消化過夜。配制1%瓊脂糖凝膠，在CHEF-DR III（美國Bio-Rad公司）上進行PFGE。電泳參數：6 V/cm，脈沖間隔時間3～40 s，0.5×TBE電泳緩沖液，電場角度120°，電泳時間24 h。

1.2.7 多位點序列分型（MLST）[11]采用PCR方法擴增肺炎克雷伯菌的7個管家基因（rpoB、phoE、gapA、infB、mdh、tonB、pgi）并進行測序，再與數據庫比對，分析菌株的序列型，標準化操作規程參見MLST網站（http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）。

2 結果

2.1 CR-HMKP流行病學資料

2012年1月－2016年12月本院住院患者分離CR-HMKP 18株，其中11株分離自痰液標本，3株分離自血液，2株分離自分泌物標本，分離自尿液和導管標本各1株。患者中10例為男性，8例為女性， 13例來自ICU。如表1所示。治療中11例患者使用過碳青霉烯類藥物，8例使用過頭孢哌酮-舒巴坦。從預后情況看出，從血液中分離出CR-HMKP的3例患者最終死亡，其他患者中經抗生素治療感染好轉11例，多數采用的是聯合抗菌藥物治療。見表1。

表1 18例感染CR-HMKP菌株患者的臨床資料Table 1 Clinical data of 18 patients infected with carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae

表1（續）Table 1（continued）

2.2 藥敏試驗結果

18株菌對抗菌藥物呈現多重耐藥現象嚴重。其中對β內酰胺類藥物和喹諾酮類藥物的耐藥率最高，對頭孢噻肟、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢唑林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢吡肟的耐藥率均為100%（18/18）；而對阿米卡星耐藥率為72.2%（13/18）。見表2。

2.3 莢膜血清分型及毒力基因檢測

18株CR-HMKP菌株中僅檢出1株K1型菌株，2株K2型菌株， 1株K57型菌株，1株K20型菌株。經wzi分型測序確認發現13株wzi64-K14.64型菌株，1株wzi20-K20，2株wzi2-K2，1株wzi128-K1，1株wzi206-K57。所有菌株均攜帶有毒力相關基因，其中有rmpA（88.9%， 16/18）、magA（5.6%， 1/18）、iroN（83.3%， 15/18）、aerobactin（27.8%， 5/18）、rmpA2（66.7%，12/18）及mrkD（100%， 18/18）。見表3。

2.4 耐藥表型和耐藥基因檢測

17株CR-HMKP菌株mCIM試驗陽性，并PCR產物經測序證實全部攜帶碳青霉烯酶，包括17株攜帶blaKPC-2基因，2株攜帶blaNDM-l基因。也存在部分β內酰胺酶、PMQR的16S rRNA甲基化酶基因：3株攜帶blaCTX-M-3，18株攜帶blaCTX-M-14，16株攜帶blaTEM-1，17株攜帶blaSHV-12，18株攜帶qnrS1基因，5株攜帶rmtB基因。見表3。

2.5 質粒接合轉移試驗結果

17株CR-HMKP菌株中有5株可以通過轉移接合將blaKPC-2基因轉移給大腸埃希菌J53菌株，轉移頻率多在105～107。所有接合子均通過VITEK 2-Compact鑒定，并與大腸埃希菌J53進行同源性確認一致。部分菌株接合試驗可使碳青霉烯類抗生素對受體菌大腸埃希菌J53的MIC值從≤0.062 5或0.125 mg/L上升到16或32 mg/L，其他β內酰胺類藥物MIC也有較大幅度的升高，見表4。

2.6 PFGE及MLST分析菌株同源性

MLST結果顯示18株CR-HMKP菌株共分為3個ST分型，其中ST11型15株，ST86型2株，ST412型1株。而PFGE將18株CR-HMKP菌株分為3種PFGE型，其中A型15株，包括A1型10株、A2型5株；B型2株；C型1株（圖1）。

表2 18株CR-HMKP對抗菌藥物敏感率和耐藥率Table 2 Susceptibility of 18 strains of carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents[ n (%) ]

3 討論

HMKP因其毒力強、可引起肝膿腫及播散性感染而被廣泛報道[12]，目前已在中國各大醫院中均有報道。然而，關于CR-HMKP菌株的耐藥機制及分子流行病學研究卻較為少見。本研究通過對肺炎克雷伯菌高黏型的調查，發現CR-HMKP在CRKP菌株檢出率達2.7%（18/675），高于之前的散發報道[13]。

莢膜一直以來作為肺炎克雷伯菌的主要毒力因子，而根據莢膜多糖建立的分型方法可將肺炎克雷伯菌分為不同的莢膜血清分型。到目前為止，肺炎克雷伯菌至少包含78個莢膜血清型，其中K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57和KN1被認為是高毒力肺炎克雷伯菌的主要莢膜血清分型[14]。Zhan等[6]曾發現溫州地區暴發流行的ST11型CR-HMKP菌株主要為K20莢膜血清型。Zhang等[15]曾從5株CR-HMKP菌株中發現僅1株為K2型，而不同的是，Yao等[4]從7株CR-HMKP菌株中發現6株均為K2莢膜血清型，也有研究發現5株致死性感染的CR-HMKP菌株均為K1。而本課題組之前研究也發現1株產KPC酶的K1型CR-HMKP菌株[5]。本研究從CR-HMKP菌株中檢出4種高毒力的莢膜血清型（K1、K2、K20、K57），并通過wzi分型發現分別為wzi128-K1、wzi2-K2、wzi20-K20及wzi206-K57型，其他CR-HMKP菌株的莢膜血清型均為wzi64-K14.64型，這表明本地區CR-HMKP菌株除存在于常見的高毒力莢膜血清型CR-HMKP菌株外，大部分菌株還是屬于常見“經典”肺炎克雷伯菌（cKP）菌株轉化而來。此外，單純采用PCR進行莢膜血清型分型對CR-HMKP的毒力判斷或存在一定的不確定性，或可通過聯合wzi分型等CPS檢測方法綜合評估，然而其具體毒力需要通過相關毒力學試驗進一步研究。

表3 18株CR-HMKP菌株的表型特征、分子流行及耐藥毒力分子特征Table 3 Phenotypic and genotypic profiles of 18 strains of carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae

表3（續）Table 3（continued）

表4 受體菌J53、CR-HMKP供體菌及其接合子Table 4 Susceptibility of the carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae donor strain，recipient J53 and the conjugant

圖1 CR-HMKP菌株PFGE電泳圖Figure 1 Pulsed field gel electrophoresis patterns of carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae strains

糖尿病一直是被看作為CR-HMKP的重要危險因素[16]。本研究僅發現16.7%（3/18）CRHMKP感染患者存在糖尿病基礎疾病，但有83.3%（15/18）的患者CR-HMKP感染時血糖升高，這表明血糖的控制或是影響CR-HMKP感染更為關鍵的因素。本研究中61.1%（11/18）的CR-HMKP感染患者在CR-HMKP菌分離前2周內使用過碳青霉烯類抗生素。碳青霉烯類抗生素的使用或可對CR-HMKP菌產生選擇作用，促進了CR-HMKP菌的流行。77.3%（13/18）的CR-HMKP菌株來自于各ICU，且CR-HMKP感染后病死率高達44.4%（8/18），這表明CR-HMKP菌更易對重癥及免疫力低下的患者發生感染。

Gu等[17]也曾從1株CR-HMKP菌株中同時發現了毒力質粒和耐藥質粒共存狀態，提示耐藥質粒進入HMKP菌株中或將是CR-HMKP形成的主要原因，提示攜帶KPC-2型碳青霉烯酶的質粒傳遞是造成本地區CR-HMKP形成的主要原因。本組資料顯示，未見部分菌株的KPC質粒發生接合試驗傳遞；與此同時發現在發生轉移接合的菌株中，未檢測到毒力基因的轉移；推測KPC質粒在進入HMKP菌株中的難度或高于cKP菌株，而HMKP菌株中的毒力基因也不易轉移到敏感菌株中。這也直接反映在臨床CR-cKP菌株的流行程度明顯高于CR-HMKP菌株。

綜上所述，本研究闡述了CR-HMKP菌株在本地區的流行情況及碳青霉烯類耐藥產生的可能原因。有效的監測和嚴格的感染控制策略或將有助阻止CR-HMKP菌株的感染擴散，尤其是在ICU等重點科室的暴發流行。

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