肺炎克雷伯菌臨床株喹諾酮類耐藥性及ST494型菌株耐藥機制分析

袁瑾懿， 徐曉剛， 胡付品， 郭 燕， 楊 洋， 董 棟， 徐慶慶， 丁百興， 王明貴

肺炎克雷伯菌是臨床最重要的條件致病菌之一，可導致肺部感染、尿路感染、血流感染、化膿性肝膿腫、眼內炎、腦膜炎等多種感染性疾病，重則威脅生命[1-2]。其耐藥率逐年升高，尤其多重耐藥菌株日益增多，已成為全球關注焦點[3]。

多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是最常用的細菌基因分型方法之一，肺炎克雷伯菌的MLST方法最初建立于2005年[4]，后被廣泛用于對肺炎克雷伯菌臨床菌株耐藥性、毒力等的特征分析和分子流行病學研究[5]。

ST11為我國肺炎克雷伯菌臨床株中最主要型別，ST15、23和29型等亦多見[6-7]。ST11型肺炎克雷伯菌為常見耐藥克隆，已有產碳青霉烯酶（KPC-2和VIM-1等）、超廣譜β內酰胺酶（CTX-M和SHV等）和16S rRNA甲基化酶的ST11型肺炎克雷伯菌在世界各地流行[8-10]。除β內酰胺酶和16S rRNA甲基化酶外，ST11型肺炎克雷伯菌還常同時存在喹諾酮耐藥決定區（QRDR）突變、并攜帶質粒介導喹諾酮耐藥基因，故常呈多重耐藥[11]。ST11型多重耐藥肺炎克雷伯菌近年在中國廣泛傳播[12-14]。不同于歐美國家以ST258型為主[15]，我國碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌主要為ST11型、其次為ST15型[16-17]。我國替加環素耐藥肺炎克雷伯菌株也是以ST11和ST15型為主[18-19]。

為了解復旦大學附屬華山醫院臨床分離肺炎克雷伯菌基本情況，本研究收集2010年本院臨床分離肺炎克雷伯菌112株進行耐藥性及分子流行病學分析，以期對本院肺炎克雷伯菌耐藥克隆傳播的防控及抗菌治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 連續收集2010年3－5月我院臨床分離的肺炎克雷伯菌，按常規方法進行菌種鑒定，剔除同一患者同一部位重復分離菌株，共獲得112株。質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922為本研究所臨床微生物室保存菌株。

1.1.2 病史資料 采集患者住院期間的病史資料，包括性別、年齡、科室、標本來源和菌株分離時間等資料。

1.1.3 主要試劑 藥敏試驗所用萘啶酸為Sigma-Alorich公司產品（純度≥98%），余抗菌藥物粉劑來自中國藥品生物制品檢定所標準品或對照品，PCR相關試劑均為大連TaKaRa公司產品。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂稀釋法測定抗菌藥敏感性 按照美國臨床與實驗室標準化協會（CLSI）文件[20]推薦的瓊脂稀釋法測定抗菌藥物對受試菌株的MIC。替加環素按照美國FDA規定的折點（http://www.pfizerpro.com/hcp/tygacil）判定耐藥、中介和敏感，其他抗菌藥物按照2017年CLSI規定的折點判定（其中萘啶酸和諾氟沙星采用尿液分離菌標準）。

1.2.2 MLST 分型根據http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html網站提示設計引物并對部分菌株進行PCR擴增，產物送杰里生物科技公司測序，測序結果提交該網站進行分析，并使用eBURST V3在線軟件（http://eburst.mlst.net/）進行聚類分析。

1.2.3 耐藥基因檢測 參考文獻設計引物并對部分菌株PCR擴增檢測16S rRNA甲基化酶armA、rmtB、rmtD基因[21]、gyrA和parCQRDR[22]、多重耐藥外排泵oqxAB基因[23]、質粒介導喹諾酮耐藥元件qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6')-lbcr和qepA基因[24-29]、β內酰胺酶基因blaCTX-M1組、2組、9組和8/25/26組[30-31]、blaSHV和blaTEM和碳青霉烯酶blaKPC[32]。

1.2.4 統計學方法 采用IBM SPSS statistics 20軟件進行統計分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher's exact test，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌臨床株來源

112株肺炎克雷伯菌臨床株主要來源于痰標本（76株，67.9%），19.6%來源于尿標本（22株），血培養（5株）和其他無菌體液（4株）標本共占8.0%。

94.6%（106株）的受試菌株分離自住院患者，共涉及11個科室，其中老年科（25/106，23.6%）、腦外科（23/106，21.7%）、康復科（19/106，17.9%）和ICU（12/106，11.3%）為主要科室來源，綜合病房、普外科、感染科、神經內科、內分泌科、腎內科、消化科、骨科等亦有分布。

2.2 肺炎克雷伯菌臨床株藥敏試驗結果

受試肺炎克雷伯菌對喹諾酮類耐藥程度高（表 1）。

表1 112株肺炎克雷伯菌臨床株對常用喹諾酮類的藥敏試驗結果Table 1 Susceptibility profile of 112 K. pneumoniae strains to the commonly used quinolones

2.3 MLST

受試菌株在環丙沙星各MIC層均有分布，故根據該藥MIC分層，選取代表性菌株48株進行MLST。選擇菌株包括全部15株環丙沙星MIC≥128 mg/L菌株、13株MIC≤0.015 mg/L菌株中的9株、以及其間各MIC梯度分別1～4株。

48株肺炎克雷伯菌臨床株進行MLST分析，結果歸為4個克隆復合體（CC）、22個ST型：最常見的為CC1型（均為ST11），CC2～CC4型各含2～3株臨床株，余菌株不屬于任何CC型。值得注意的是，僅次于ST11型（15株），18.8%受試肺炎克雷伯菌為ST494型（9株），余ST型各含1～2株受試株。

環丙沙星敏感率下降菌株中存在克隆傳播趨勢：CC1（ST 11）、CC4（ST15和ST655）和ST494菌株均對環丙沙星不敏感（MIC分別為16～＞128 mg/L、4～128 mg/L和2～8 mg/L），以上各ST型菌株共占環丙沙星不敏感菌株86.2%（25/29）。而19株敏感菌株分屬17個ST分型，未呈現明顯克隆集中現象。

2.4 ST494型肺炎克雷伯菌耐藥性及耐藥機制

2.4.1 臨床背景 ST分型共發現9株ST494型菌株，均分離自不同患者；標本來源于痰（7株）、尿和傷口分泌物；3株分離自同一病區，3株分離自腦外科3個不同病區，ICU、骨科和腎內科各分離1株。

2.4.2 耐藥表型 ST494型菌株對慶大霉素、萘啶酸、頭孢他啶、頭孢噻肟均耐藥；但對四環素、替加環素均敏感。比較ST494型、ST11型和非ST494/11型3組菌株對受試常用抗菌藥物的敏感率，結果有顯著差異：ST11型菌株對氟喹諾酮類的耐藥率顯著高于ST494型和非ST494/11型菌株；ST11型菌株對阿米卡星和β內酰胺類的耐藥率也高于非ST494/11型菌株、而與ST494型菌株無明顯差異；ST11型菌株對替加環素和四環素的耐藥率與非ST494/11型無顯著差異、而對四環素的耐藥率高于ST494型菌株（P=0.006）；ST494型菌株對受試氨基糖苷類、喹諾酮類、β內酰胺類藥物敏感率均低于非ST494/11菌株（表2）。

表2 ST494型、ST11型與非ST494/11型肺炎克雷伯菌臨床株對抗菌藥物敏感性Table 2 Susceptibility of K. pneumoniae strains - antimicrobial agents in terms of ST494， ST11 and non-ST494/11

表2（續）Table 2（continued）

2.4.3 耐藥基因 5株對阿米卡星、慶大霉素高度耐藥（MIC均＞256 mg/L）的菌株均攜帶armA基因，9株ST494型菌株均未檢出rmtB、rmtD基因。

9株ST494型肺炎克雷伯菌臨床株gyrA的QRDR均存在單位點突變，其中8株為S83Y、1株為S83I，praC的QRDR未發現有意義點突變。受檢肺炎克雷伯菌均攜帶多藥外排泵基因oqxAB，根據既往文獻[23]，考慮為染色體攜帶。對9株ST494型肺炎克雷伯菌進行質粒介導喹諾酮耐藥基因篩查，其中3株同時攜帶qnrD和aac(6')-lb-cr基因，1株攜帶aac(6')-lb-cr基因，未檢出qnrA、qnrS、qnrB、qnrC或qepA基因。

9株均同時攜帶blaCTX-M1組、blaSHV和blaTEM基因，其中2株同時產blaKPC酶，這2株菌對哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南耐藥。

3 討論

肺炎克雷伯菌臨床株對常用抗菌藥耐藥物日益嚴重，使臨床抗感染治療面臨極大挑戰。我院分離肺炎克雷伯菌臨床株對環丙沙星敏感率為28.6%，遠低于同期CHINET數據[33]。經MLST分析提示，我院分離環丙沙星不敏感肺炎克雷伯菌臨床株中存在克隆傳播趨勢：CC1（ST11）、CC4（ST15和ST655）以及ST494菌株共占環丙沙星不敏感菌株的86.2%。既往報道ST494型菌株僅在產KPC酶肺炎克雷伯菌臨床株被發現，占受試菌株0.5%（2/378）～5.7%（2/35）[34-35]。而本研究發現ST494型菌株占受試臨床株18.9%，居于第2位。ST494型成為臨床分離肺炎克雷伯菌主要克隆之一，這一現象為我院特有。這或可解釋我院肺炎克雷伯菌菌株對氟喹諾酮類敏感率甚低這一現象。當然，本研究菌株僅為短期內集中收集，可能存在選擇偏倚，有待更大規模研究佐證。

為了解ST494型菌株對我院肺炎克雷伯菌臨床株耐藥性影響，對其進行進一步分析，發現除對替加環素和四環素100%敏感、美羅培南敏感率78%外，其對常用抗菌藥物敏感率均低于50%。ST494型菌株均攜帶blaCTX-M1組、blaSHV和blaTEM等多種β內酰胺酶基因，因而對所有頭孢菌素均耐藥；其中22.2%菌株同時產KPC酶，導致對碳青霉烯類耐藥；ST494型菌株均存在gyrA的QRDR單位點突變，均攜帶oqxAB基因，部分攜帶qnrD和aac-(6')-lb-cr，導致對喹諾酮類敏感率下降；對氨基糖苷類耐藥率高達56%～100%，產16S rRNA甲基化酶armA是其主因。有意思的是，ST494型肺炎克雷伯菌不僅對替加環素均敏感，而且對四環素也有很高敏感率，MIC僅2～4 mg/L。

qnrD基因首先在我國臨床分離沙門菌中被發現[26]，接合轉入該基因能使受體菌環丙沙星MIC提高32倍（從0.002到0.06 mg/L）。qnrD基因多見于沙門菌屬、變形桿菌屬和大腸埃希菌中，檢出率低于qnrA、qnrB或qnrS。檢索PubMed和EMBASE數據庫發現僅報道臨床分離肺炎克雷伯菌攜帶qnrD基因2株：其一來自我國某醫院分離人類尿標本菌株，同時攜帶aac(6')-lb-cr基因[36]；另一來自匈牙利某大學醫院血培養標本，同時產ESBL[37]。而本研究在ST494型肺炎克雷伯菌中檢出攜帶qnrD肺炎克雷伯菌臨床株3株，陽性率高達33.3%，或為該ST型肺炎克雷伯菌基因特征之一。

ST494型肺炎克雷伯菌臨床株在我院為常見克隆之一，其對喹諾酮類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類等多種常用抗菌藥物均有較高耐藥率，或為我院肺炎克雷伯菌臨床株對喹諾酮類高度耐藥的原因之一；但ST494型菌株對四環素、替加環素均敏感，在替加環素價格昂貴且無口服制劑的現狀下，價格低廉、生物利用度高、可靜脈/口服序貫使用的四環素類藥物，如多西環素、米諾環素，不失為治療肺炎克雷伯菌感染的良好選擇之一。

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