黃秋葵花提取物不同極性部位抗氧化活性的研究

郭溆，李文剛，田碩，曹宏杰，王維婷，劉超，程安瑋，王新坤，孫金月，*

（1.山東省農業科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南250100；2.山東省農業科學院試驗基地服務中心，山東濟南250100；3.濟南市畜產品質量安全監測中心，山東濟南250000）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）屬于錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Abelmoschus Medic）一年生草本植物，是一種具有較高營養價值的新型保健蔬菜，抗疲勞效果佳[1]。自引入我國后，在山東、浙江、福建、江西、廣州、北京等多省市種植，選種的品種也較多。黃秋葵的花具有花期短、產量大的特點，因此具有很強的開發應用潛能，現在已經有大量的黃秋葵花茶在售，市場前景較好。

自由基與活性氧是機體在正常有氧呼吸過程中產生的物質，若不及時清理，就會破壞人體內的動態平衡，使人體處于氧化應激狀態，易引發疾病與衰老[2]。開發自由基清除劑和抗氧化劑已經受到了人們的重視，但化學合成抗氧化劑因具有潛在的毒、副作用，因此從植物中尋找天然抗氧化劑已經成為研究熱點[3]。黃秋葵花中富含黃酮、多酚、多糖、氨基酸等多種物質[4]，其中黃酮和多酚類化合物是植物抗氧化活性的主要物質基礎[5-6]。目前對黃秋葵抗氧化活性的研究主要集中在果實中，對黃秋葵花的研究還很少。李孟秋等實驗證明黃秋葵花水提物的抗氧化活性較好[7]。本研究以黃秋葵花乙醇提取物為研究對象，采用萃取法將黃秋葵花乙醇提取物分為乙酸乙酯相和水相兩個部位，對兩個不同極性部位中的總酚和黃酮含量進行了測定，并分別對其抗氧化活性進行分析，為黃秋葵花的合理開發利用提供理論依據，也為天然抗氧化劑和功能性食品開發提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 原料

黃秋葵品種卡里巴：2016年春播種于山東省農科院農產品研究所章丘龍山試驗基地，采集其盛開的花器官作為試驗材料，經干燥脫水后，粉碎過80目篩，置常溫干燥處備用；采用有機溶劑萃取法將黃秋葵花乙醇提取物分為乙酸乙酯相和水相部位。

1.2 試劑與儀器

蘆丁標準品、沒食子酸標準品、1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸鹽緩沖液（pH6.6）、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、乙醇、Tris-HCl-EDTA緩沖液、鄰苯三酚：國藥集團化學試劑有限公司。

UV-1800型紫外分光光度計：日本島津公司；FE20K型臺式酸度計：美國梅特勒-托利多公司；AR423CN型電子天平：美國奧豪斯公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏公司；Allegra 25R型高效冷凍離心機：美國貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵花不同極性溶劑提取物制備

在乙醇體積分數80%、料液比1∶50（g/mL）、溫度60℃條件提取1 h，提取2次，過濾；將濾液低壓濃縮至膏狀物質，取部分冷凍干燥，得到醇提物干樣；加入定量的水將上述剩余的膏狀物質溶解后，充分搖勻，轉入分液漏斗中。用乙酸乙酯進行萃取3次，得到乙酸乙酯部位和水提部位的萃取物。將各組萃取物減壓濃縮后，真空冷凍干燥至恒質量，密封置于冰箱冷藏備用。

1.3.2 蘆丁標準曲線的制作

采用Al（NO3）3法測定[8]。準確稱取經120℃烘干至恒質量的蘆丁標準品1 g，80%乙醇溶解后定容至100 mL，搖勻，得0.5 mg/mL蘆丁標準溶液。分別精密量取蘆丁標準溶液 0、1、2、3、4、5、6 mL，各加 80%乙醇溶液至10 mL，再加入0.7 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，避光靜置反應6 min后，加入0.7mL的10%硝酸鋁，搖勻，靜置6 min，加入5.0 mL的4%氫氧化鈉，用25%乙醇定容至25 mL后搖勻放置15 min后，于波長510 nm處測定其吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，標準方程Y=1.410 6x+0.007 3，R2=0.997 6。式中：Y為吸光度；x為黃酮質量濃度，mg/mL。

1.3.3 沒食子酸標準曲線的制作

采用Folin-Ciocalteu方法測定[9]。準確稱取經120℃烘干至恒質量的沒食子酸標準品0.05 g，80%乙醇溶解定容至50 mL，得到1 mg/mL沒食子酸標準溶液。分別精密量取沒食子酸標準溶液 1、2、3、4、5 mL，各加80%乙醇溶液至10 mL，各吸取200 μL后加入1.0 mL蒸餾水、福林酚試劑0.2 mL混勻，靜置3 min后，加入7.5%碳酸鈉溶液0.6 mL后混勻，室溫靜置40 min后，于波長765 nm下測定器吸光值。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，標準方程Y=2.151x-0.032 6，R2=0.992 5。式中：Y為吸光度；x為多酚質量濃度，mg/mL。

1.3.4 黃秋葵花不同極性部位中總黃酮、多酚含量測定

準確稱取黃秋葵花萃取物0.01 g，溶于10 mL 80%乙醇中，配制成1 mg/mL溶液，代入到各標準曲線中，測定萃取物中總黃酮、多酚含量。

1.3.5 還原力的測定

將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的濃度，用相同濃度的VC溶液做對照。取各濃度的樣品液1 mL于試管中，分別加0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的K3Fe（CN）6溶液各2.5 mL，混勻后將試管在50℃水浴鍋中反應20 min，取出放置室溫，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻后靜置10 min，取出2.5 mL，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的 FeCL3，混勻后反應 10 min，在700 nm處測定吸光度。

1.3.6 清除DPPH自由基活性的測定

配制濃度為1×10-4mol/L的DPPH溶液。量取配制好的 DPPH 溶液 2、4、6、8、10 mL 于 10 mL 容量瓶之中，用無水乙醇定容后在517 nm波長下測吸光度并記錄，制作標準曲線。將VC、水相和乙酸乙酯相分別配制成濃度為 0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 mg/mL的溶液。各取1.00 mL溶液，分別加入1mL DPPH溶液，室溫避光反應15 min，在517 nm波長下下測定吸光度A樣品，用1 mL無水乙醇與1.00 mL樣品溶液調零，消除樣品本身的顏色對吸光度的影響。向1 mL DPPH溶液中加入1 mL相應樣品溶劑，記錄吸光度為A空白，用1 mL無水乙醇與1 mL相應樣品溶劑調零，以扣除溶劑的影響。

清除率計算公式：DPPH自由基清除率/%=（A空白-A樣品）/A空白×100。

1.3.7 清除羥自由基的測定

將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的溶液，相同濃度的VC溶液做對照。取1 mL樣品，分別加入1.8mmol/LFeSO42mL和1.8mmol/L水楊酸-乙醇1.5 mL，再加入0.03%H2O20.1 mL在37℃反應 30 min，8 000 r/min離心 10 min，510 nm 測定吸光度Ax。另用1 mL蒸餾水代替樣品溶液做空白對照測定吸光值A0，1 mL的蒸餾水代替雙氧水測定吸光度AX0。

清除率計算公式為：羥自由基清除率/%=[（A0-（AX-AX0））/A0]×100

1.3.8 清除超氧陰離子自由基的測定

將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.000 5、0.001 1、0.005.、0.01、0.021、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的溶液，相同濃度的VC溶液做對照。取4.5 mL pH值為8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液加入0.5 mL蒸餾水25℃反應10 min，再加入10 μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻在325 nm波長下測定吸光度，每隔1 min測一次，共測4 min，計算未加入樣品時鄰苯三酚自氧化速率△A0。用樣品替代蒸餾水重復上述試驗，計算入樣品后鄰苯三酚自氧化速率△A。

清除率計算公式：超氧陰離子自由基清除率/%=（△A0-△A）△A0×100

2 結果與分析

2.1 黃秋葵花提取物不同極性部位總黃酮和多酚含量

黃秋葵花水提部位總黃酮含量為（43.14±1.46）mg/g，總酚含量為（66.42±2.63）mg/g。乙酸乙酯提取部位總黃酮含量為（352.78±20.73）mg/g，總酚含量為（405.2±23.02）mg/g。乙酸乙酯部位的總黃酮和多酚含量要多于水提部位。

2.2 還原力的測定結果

采用鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法測定，其作用機理是抗氧化物質在較低pH值條件下可將Fe3+還原為Fe2+，在700 nm處檢測吸光值，值越大還原能力越強即抗氧化能力越強[10]。還原力的測定結果見圖1。

圖1 黃秋葵花不同極性部位提取物的還原能力Fig.1 Reducing power abilities of different polarity fractions from okra flowers

如圖1所示，黃秋葵花乙酸乙酯相和水相提取物均表現出不同程度的還原能力，具有明顯的量效關系，水提部位提取物的還原力要大于陽性對照，乙酸乙酯部位提取物的還原力要弱于陽性對照。

2.3 對DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的作用機理是在抗氧化劑的作用下，紫色的DPPH自由基可被還原為黃色的非自由基DPPH-H，在517 nm處檢測吸光值，一定范圍內吸光值變化程度與自由基清除程度呈線性關系[11]。對DPPH自由基清除能力見圖2。

由圖2可以看出，樣品對DPPH自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強，水提部位清除DPPH自由基活性明顯優于乙酸乙酯提取部位和VC。

為了便于比較不同物質的抗氧化能力，常用IC50值表示抗氧化物質對DPPH自由基的清除能力，即對自由基清除率為50%時所對應抗氧化劑的質量濃度。IC50值越小，表明該物質清除自由基的能力越強。黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH自由基的IC50見表1。

圖2 黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH能力Fig.2 DPPH scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

表1 黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH自由基的IC50Table 1 IC50of DPPH scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

由表1可知，黃秋葵花水提部位IC50值最小，而乙酸乙酯相值最大，表明它們的DPPH自由基清除能力大小依次為水相＞VC＞乙酸乙酯相。

2.4 對羥自由基的清除能力

清除羥自由基的作用機理是羥基自由基可與水楊酸分子上的苯環作用產生2，3-二羥基苯甲酸，在510 nm處可檢測吸光值，若反應體系中存在抗氧化劑，吸光值就會降低[12]。對羥自由基的清除能力見圖3。

圖3 黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

由圖3可知，在考察濃度范圍內，隨著濃度的逐漸增大，VC、水相和乙酸乙酯相表現出清除羥自由基的能力越來越強，量效關系非常明顯，尤其是乙酸乙酯相，很小的濃度變化就對清除率產生很大的影響。

黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基的IC50見表2。

表2 黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基的IC50Table 2 IC50of hydroxyl free radical scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

由表2可知，乙酸乙酯提取部位清除羥自由基的IC50值最小，為14.04 μg/mL，因此清除羥自由基的能力的大小順序為：乙酸乙酯提取部位＞水相提取部位＞VC。

2.5 清除超氧陰離子自由基的能力

鄰苯三酚自氧化法清除超氧陰離子自由基的作用機理是鄰苯三酚在弱堿性條件下會發生自氧化反應會產生有色中間物質，若加入抗氧化物質會阻斷有色物質的積累，限制鄰苯三酚的自氧化，可在325 nm處檢測吸光度值變化情況[13]。由清除超氧陰離子自由基的能力見表4。

圖4 黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的能力Fig.4 Superoxide anion scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

圖4所知，在考察濃度范圍內，VC的清除能力最強，乙酸乙酯提取部位的清除能力略優于水提部位，且隨著濃度的增加，其清除超氧陰離子自由基的能力增強。

黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的IC50見表3。

由表3可知，對照品VC清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為3.65 μg/mL，乙酸乙酯提取部位清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為6.19 μg/mL，水相提取部位清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為15.00 μg/mL。說明乙酸乙酯提取部位清除超氧陰離子自由基的能力強于水相提取部位。

表3 黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的IC50Table 3 IC50of superoxide anion scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

3 結論與討論

不同抗氧化能力檢測方法有不同的反應機理，本研究為了獲得更加可靠的結果，分別采用還原能力測定、清除DPPH自由基、清除羥自由基和清除超氧陰離子自由基4種不同方法對黃秋葵花不同極性部位提取物的抗氧化能力進行評價。研究發現黃秋葵花不同極性部位提取物對Fe3+、DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均具有不同程度的抗氧化能力，且隨著濃度的升高抗氧化能力不斷提高，說明總黃酮和多酚含量與抗氧化活性之間具有良好的量效關系。由于不同抗氧化評價方法的測定原理不同，不同極性部位抗氧化能力的強弱順序有可能不一致，本研究中水相的還原能力和清除DPPH自由基的能力較強，強于VC，乙酸乙酯相最弱；水相和乙酸乙酯相對羥自由基的清除能力均較強，極低的濃度就具有較高的清除羥自由基活性且強于VC；水相和乙酸乙酯相清除超氧陰離子自由基的能力均弱于VC。

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