酶法協同微波提取桑椹多糖工藝優化的研究

楊樺，鄺思碧，鄒宇曉，黎爾納，*，王弘

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州510642；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

桑椹在我國食用歷史悠久，已被列入首批“藥食同源”名單[1-2]。桑椹營養豐富且富含多糖、多酚、生物堿和揮發性油等功能物質，具有降血糖、降血脂、增強免疫力和抗腫瘤[3]等活性作用，深入的研究發現并證實桑椹多糖是上述活性的重要物質基礎[4-5]。

多糖（polysaccharide）是一類復雜的糖類物質，廣泛存在于微生物、植物的細胞壁和動物的細胞膜中。馬明蘭等[6]采用沸水浸提法提取桑椹多糖，精制桑椹多糖提取率可達到2.63%。有研究表明桑椹多糖有抗衰老、降血糖和護肝的功效[7]。自由基學說認為：衰老可能與代謝過程中連續產生的自由基的摧毀性連鎖反應有密切關系[8]。楊聯河[9]通過實驗發現，桑椹多糖可顯著提升衰老模型小鼠紅細胞超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和全血谷胱甘肽過氧化物酶活性水平（P≤0.05），顯著降低衰老模型小鼠血漿、腦勻漿及肝勻漿中過氧化脂質的含量（P≤0.05）。桑椹多糖的攝入可顯著升高酒精性肝損傷模型小鼠肝臟超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性，同時降低血液谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平（P≤0.05），有效改善小鼠肝損傷狀況，推測桑椹多糖對酒精性肝損傷的抑制作用可能與抗氧化機制相關[10]。傳統桑椹多糖提取采用水提法，需要多次重復浸提多糖才得以釋放，操作時間長，得率低。酶法提取和超聲波提取是近年來發展較快的提取方法，具有提取時間短和能耗低的特點[11-12]。

本試驗針對單一的酶法提取或超聲波提取桑椹多糖提取率不高的問題，擬結合生物酶法和物理場處理技術，通過單因素試驗與Box-Behnken設計法對桑椹多糖提取工藝進行優化，進而確定桑椹多糖的最佳提取工藝，為桑椹多糖功能食品研究提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

桑椹干：采摘八、九成熟的新鮮桑椹，放置于60℃烘箱中烘干，食品級包裝袋真空包裝后置于-20℃冰箱中保存備用；纖維素酶（1 800 U/mg）、果膠酶（1 000 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）：廣州市齊云生物技術有限公司；濃硫酸、苯酚、葡萄糖、無水乙醇：分析純，廣州化學試劑廠。

SQP型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；WD750B型微波爐：順德格蘭仕電器廠有限公司；FW100型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計：島津企業管理（中國）有限公司；CR22G III型高速冷凍離心機：廣東廣州日立工機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桑椹粗多糖的提取工藝流程

桑椹→60℃烘干→粉碎（過20目篩）→稱取桑椹粉末5 g→酶解（2.5 h，37℃）→微波萃取→減壓抽濾→濃縮→四倍體積無水乙醇醇沉→4℃過夜→離心（10 000 r/min，10 min）→去上清，加水溶解沉淀→定容至50 mL→桑椹粗多糖溶液[13]

1.2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸比色法，吸取一定體積的葡萄糖標準溶液，依次定容至2 mL；精密吸取桑椹粗多糖溶液1.25 mL，加水稀釋至50 mL。分別取葡萄糖標準液稀釋液、桑椹多糖稀釋液1.0 mL于10 mL試管中，再取1.0 mL蒸餾水作為空白對照，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，再加入濃硫酸5.0 mL，混合均勻，室溫靜置30 min，490 nm下測其吸光值。

1.2.2.1 葡萄糖標準溶液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖500 mg，加少量蒸餾水溶解，轉移至500 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

1.2.2.2 標準曲線的繪制

吸取葡萄糖標準液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，定容至25 mL，得到不同濃度的葡萄糖稀釋液，分別取1.0 mL稀釋液于試管中，按2.2.4的操作顯色，于490nm處測定吸光值。以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖質量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：A=0.009 2C+0.044 6，R2=0.990 7。

1.2.2.3 桑椹多糖提取率的計算

多糖提取率/%=（C×V×D）/（W×106）×100

式中：C為測得的樣品溶液稀釋液的多糖濃度，μg/mL；V為樣品溶液稀釋液的體積，mL；D為樣品溶液的稀釋倍數；W為樣品的質量，g。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 酶的種類對多糖提取率的影響

研究選取3種酶進行試驗：果膠酶、胃蛋白酶和纖維素酶。分別稱取果膠酶0.05 g，胃蛋白酶0.016 7 g，纖維素酶0.027 8 g，加少量蒸餾水溶解，分別定容至50 mL，配制成酶活力均為1 000 U/mL的酶液，4℃保存備用。

稱取5 g桑椹粉置于錐形瓶中，分別加入相同體積5mL的3種不同酶液，與未加酶進行空白對照，并按料液比1∶25（g/mL）補齊蒸餾水，37℃水浴酶解2.5 h，100℃滅酶10 min，提取多糖后測量并計算多糖含量。

1.2.3.2 酶添加量對多糖提取率的影響

分別加入 0、1、3、5、7、9 mL 的纖維素酶液，37 ℃水浴酶解2.5 h，100℃滅酶10 min，研究不同酶液添加量對多糖提取率的影響。

1.2.3.3 微波處理時間對多糖提取率的影響

加入7 mL纖維素酶液，37℃水浴酶解2.5 h，100℃滅酶10 min。在微波功率為450 W，研究不同微波時間（30、60、90、120、150 s）對多糖提取率的影響。

1.2.3.4 微波功率對多糖提取率的影響

加入7 mL纖維素酶液，37℃水浴酶解2.5 h，100℃滅酶10 min。在微波時間為60 s，研究不同微波功率（150、300、450、600、750 W）對多糖提取率的影響。

1.2.4 響應面法對桑椹多糖提取條件的優化

綜合單因素提取多糖的試驗結果，根據Box-Benhnken[14]的中心組合試驗設計原理，采用響應面法在三因素三水平上的響應面分析方法對工藝參數進行優化[15-16]。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與討論

2.1 單因素試驗各因素對多糖提取率的影響

2.1.1 酶的種類對多糖提取率的影響

酶的種類對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 酶的選擇對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different kinds of enzymes on the polysaccharides extraction rate

由圖1可知，與空白對照組相比，經纖維素酶處理后桑椹多糖提取率顯著增加（P≤0.05），多糖提取率達到2.31%。果膠酶組的多糖提取率略有增高，但與對照組差異不顯著（P≥0.05）。添加胃蛋白酶處理的桑椹對多糖提取率無明顯影響。由于桑椹的細胞壁主要是由纖維素構成的，纖維素酶的處理可以破壞細胞壁中β-D-葡萄糖苷鍵，促進細胞壁中多糖的釋放。據此，選擇纖維素酶作為提取桑椹多糖所用的酶。

2.1.2 酶添加量對多糖提取率的影響

酶添加量對多糖提取率的影響見圖2。

由圖2可知，纖維素酶液的添加量從1 mL～7 mL（1 000 U/mL）范圍內，隨著酶添加量的增加，多糖提取率顯著增加（P≤0.05），呈顯著的量效關系，其中在7mL時達到2.42%。進一步將酶添加量增加到9 mL時，多糖提取率略有下降，這可能是桑椹多糖已基本提取完全，其它雜質進入提取液，使提取液黏度升高，擴散速度變慢，導致多糖不易溶出，酶量的增加對多糖有一定的抑制作用。因此選擇纖維素酶的最佳添加量為7mL。

2.1.3 微波處理時間對多糖提取率的影響

微波輻射時間對桑椹多糖提取率的影響如圖3所示。

圖2 酶液添加量對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the polysaccharides extraction rate

圖3 微波時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of wave time on the polysaccharides extraction rate

在0 s～150 s時間范圍內，隨著微波時間的延長，多糖提取率呈現出先上升后下降的現象，在微波時間為60 s時多糖提取率達到最高點，多糖得率為2.72%。之后逐漸下降。在一定的時間范圍內增加微波處理的時間，使溶劑充分滲透到細胞內，促進細胞內多糖組分提取得率增加。微波作用的時間過短，可能提取不充分，但若微波時間過長，多糖則會有一定的降解，微波輻射時間超過60 s后，部分提取物可能被破壞，導致檢測到的多糖類化合物含量有所減少。因此，選擇微波的最佳時間為60 s為宜。

2.1.4 微波功率對多糖提取率的影響

微波功率對多糖提取率的影響見圖4。

由圖4可知，在微波功率低于600 W時，隨著微波功率的增強，多糖提取率不斷增加，在微波功率為600 W時達到最大，其多糖得率為2.93%，當微波功率提高到750 W時的多糖提取率略有下降，這可能是由于功率過高使提取的桑椹多糖被水解，導致多糖含量下降。而且高功率易使溶液發生爆沸而噴灑出來，造成多糖的損失和增加危險性，因此微波功率600 W為較適宜的提取功率。

圖4 微波功率對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of wave power on the polysaccharides extraction rate

2.2 響應面試驗設計與結果分析

通過查閱相關文獻并結合本試驗，在單因素試驗結果的基礎上，以X1、X2、X3為自變量，以桑椹多糖提取率為響應值，設計多因素試驗，試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and result

對表2試驗結果采用Design Expert 7.0統計軟件進行多元回歸擬合，回歸分析結果見表3。

從表3 可知，整體模型“Prob＞F”為＜0.0001，表明該二次方程模型是高度顯著的，擬合精度好，可以利用該響應面近似模型進行后續的優化設計；微波功率、酶添加量與微波時間的交互作用的“Prob＞F”值都小于0.01，表明他們交互作用明顯。微波時間和微波功率的二次方也為極顯著影響因子。模型失擬項（Lack of Fit）指的是模型預測值與實際值不擬合的概率，該模型中失擬項“Prob＞F”為 0.207 6，遠大于 0.05，說明該模型的失擬項不顯著，即該模型在被研究的整個回歸區域內擬合較好；同時該回歸模型決定系數R2=0.9905，說明相關性較好。由此可見，該回歸方程可以很準確地描述各個因素與響應值之間的真實關系，可以選擇該模型來分析桑椹多糖提取率的變化。

表3 多糖提取率回歸分析結果Table 3 The results of variance analysis on the polysaccharides extraction

由于纖維素酶添加量、微波時間和微波功率3個因素對干桑椹多糖提取率的影響并不是簡單的線性關系，采用Design Expert 7.0統計軟件對表2數據進行多元回歸分析，獲得多糖提取率（Y）對纖維素酶添加量、微波時間、微波功率的二次多元回歸方程：Y=-7.49663+0.18525X1+0.050533X2+0.02704X3-1.541 67×10-3X1X2-9.16667×10-5X1X3-3.333 33×10-6X2X3-1.625 00×10-3X12-3.211 11×10-4X22-2.151 11×10-5X32。

2.3 因素間的交互影響

纖維素酶添加量、微波時間、微波功率三因素對干桑椹多糖提取率的交互作用曲面圖和等高線圖，分別表示以微波功率、微波時間、纖維素酶添加量取零水平時，其余兩個因素對多糖提取率的影響。

2.3.1 纖維素酶添加量與微波時間交互作用對桑椹多糖提取率的影響

纖維素酶添加量與微波時間交互作用對桑椹多糖提取率的影響見圖5。

從圖5可知，當微波時間在30 s～60 s時，隨著微波時間的延長，桑椹多糖的提取率上升，當微波時間達60 s時，多糖提取率最高。隨著微波時間的進一步延長，多糖提取率反而降低。

2.3.2 纖維素酶添加量與微波功率交互作用對桑椹多糖提取率的影響

纖維素酶添加量與微波功率交互作用對桑椹多糖提取率的影響見圖6。

圖5 纖維素酶添加量與微波時間交互作用對桑椹多糖提取率的影響Fig.5 Interaction among enzyme addition and wave time on the polysaccharides extraction rate in mulberry

圖6 纖維素酶添加量與微波功率交互作用對桑椹多糖提取率的影響Fig.6 Interaction among enzyme addition and wave power on the polysaccharides extraction rate in mulberry

從圖6可知，當微波功率在450 W～600 W時，隨著微波功率的提高，桑椹多糖的提取率上升，當微波功率達600 W時，多糖提取率最高。隨著微波功率的進一步延長，多糖提取率反而降低。而纖維素酶添加量的增加對多糖提取率的影響則較為緩和，多糖提取率僅有小幅度的上升。

2.3.3 微波時間與微波功率交互作用對桑椹多糖提取率的影響

微波時間與微波功率交互作用對桑椹多糖提取率的影響見圖7。

圖7 微波時間與微波功率交互作用對桑椹多糖提取率的影響Fig.7 Interaction among wave time and wave power on the polysaccharides extraction rate in mulberry

圖7可知，當微波時間在30 s～60 s，微波功率在450 W～600 W時，多糖提取率隨著微波時間的延長而快速上升，當微波時間達到60 s，微波功率達到600 W時，多糖得率接近最高值。當進一步延長微波時間和增加微波功率時，多糖得率降低。

2.4 最佳化分析

最佳工藝：根據所建立的響應面數學模型進行參數最佳化分析，酶法協同微波提取桑椹多糖的工藝條件為：纖維素酶添加量9 mL，微波時間53.91 s，微波功率605.25 W，在此條件下干桑椹多糖提取率的理論值為2.963 8%。考慮到實際操作的可行性及簡化工藝，將條件其修正為纖維素酶添加量9 mL，微波時間54 s，微波功率600 W。為了驗證上述最優結果，試驗結果如表4。

表4 最優試驗結果驗證Table 4 Validation of the optimal examination design

采用酶法協同微波提取桑椹多糖工藝，即：纖維素酶添加量9 mL，微波時間54 s，微波功率600 W。在修正條件下，得到實際多糖提取率為3.01%，多糖提取率比傳統不酶解和微波處理的水提工藝（即1.2.1中無酶解和微波萃取，水提2.5 h，37℃）提高了72%，效果明顯。

3 結論

本研究采用酶法協同微波提取桑椹多糖，在單因素試驗的基礎上，進行三因素三水平的Box-Behnken中心設計，優化了桑椹多糖的提取工藝。試驗結果顯示酶法協同微波提取桑椹多糖的最佳工藝為：纖維素酶添加量9 mL，微波時間54 s，微波功率600 W，在此條件下桑椹多糖的提取率為3.01%，多糖提取率比水提工藝提高了72%，效果明顯。該方法為桑椹多糖的有效提取提供新思路，縮短了提取時間，為桑椹多糖的提取及其應用奠定了良好基礎。

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