富硒平菇多糖提取純化及抗氧化活性研究

馬玲，趙亞娜，張樂，于娟，紀海玉，滕安國，劉安軍

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

補硒對于機體功能的發揮以及預防部分疾病具有重要意義，與無機硒相比，有機硒的吸收利用率以及安全性較好，而有機硒大都以硒多糖和硒蛋白的形式出現。大量研究報道生物合成和化學合成的食用菌硒多糖具有較強的抗氧化活性，李華為發現富硒金針菇中的硒多糖對羥自由基的清除活性較同濃度下無機硒和多糖混合物更強[1]。Tur?o等研究發現硒含量高的香菇提取物具有較高的抗氧化活性[2]。Yu等發現硒化毛頭鬼傘菌絲多糖體內抗氧化效果好于非硒化多糖[3]。Wang等研究得出茶葉中硒多糖組分和普通多糖相比具有更高的抗氧化活性[4]。Li等證實灰樹花中分離得到的富硒多糖比普通多糖具有更高的抗氧化活性[5]。Zhu等認為硒化蛹蟲草多糖具有更高的抗氧化活性[6]。但對富硒平菇中的硒多糖進行提取及抗氧化活性的研究還未見報道，因而本研究對富硒平菇中的硒多糖進行提取、分離，并對各組分不同濃度下的抗氧化活性進行比較，為富硒平菇的開發及生物活性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒平菇來源于山西紫團生態農業有限公司，硒的含量為622.47 mg/g干樣。

無水乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、濃硫酸、氫氧化鈉、牛血清白蛋白、焦性沒食子酸、碳酸鈉、鹽酸、醋酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷酸二氫鈉、氯化鐵、鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）、FeSO4、H2O2、水楊酸、鄰苯三酚、ABTS、過硫酸鉀、二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）、考馬斯亮藍G-250：分析純。

1.2 設備

DZF-6020型真空干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HH-2電熱恒溫水浴鍋：上海醫療器械五廠；SY-2000真空旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；UV-1100分光光度計：上海美普達儀器有限公司；BP121S電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；MP220 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；TDL-40B低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；MODULYOD-230 真空冷凍干燥機：Thermo Electron，U.S.。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取

富硒平菇（硒含量為622.47 mg/g干樣）→干燥、脫脂→熱水溶液浸提[料液比為 1 ∶20（g/mL），提取 6 h]→過濾→55℃真空濃縮→離心，棄去沉淀（2 000 r/min，10 min）→加入3倍體積乙醇→攪拌、靜置過夜→離心收集沉淀（4 000 r/min，10 min）→無水乙醇洗滌→真空冷凍干燥→Sevag法除蛋白→透析（3 500 Da）→冷凍干燥→粗多糖（Se-POP）

1.3.2 分離、純化

對所獲得的粗多糖在DEAE-cellulose纖維柱中以0.1、0.5、1.5 mol/L NaCl溶液進行洗脫得到3個洗脫峰，對分離得到的3個洗脫峰進一步經過Sephadex G-100進一步純化，得到3個分子量大小不同的組分Se-POP-1，Se-POP-2，Se-POP-3。

1.3.3 各組分中多糖含量測定

采用硫酸苯酚法測定多糖含量[7]，蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定[8]，糖醛酸含量硫酸采用咔唑比色法測定[9]，硫酸基含量采用明膠—氯化鋇法測定[10]，硒含量采用原子熒光法測定[11]，多酚含量采用福林酚法測定[12]。

1.3.4 抗氧化活性測定

1.3.4.1 對DPPH·的清除能力[13]

配制不同濃度的多糖水溶液，同時配置濃度為0.125 mmol/L DPPH甲醇溶液。取0.5 mL多糖樣液和1 mL DPPH溶液于試管中，充分振搖后，暗處室溫反應30 min，然后在517 nm處測定各處理的吸光值。對照為0.5 mL樣液和1 mL甲醇混合液的吸光值，空白為0.5 mL DPPH溶液和1 mL甲醇混合液的測定值，無水甲醇調零。按照下式計算各樣品溶液對DPPH自由基的清除率。

式中：A為樣液與DPPH混合液的吸光值；Ab為樣液與甲醇混合液的吸光值；A0為DPPH與甲醇混合液的吸光值。

1.3.4.2 羥自由基的清除能力[14]

取樣品溶液2 mL，然后依次加入2 mL濃度為6 mmol/L的FeSO4溶液，再加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，充分混勻后室溫靜置10 min，接著加入2 mL新配制的6 mmoL/L水楊酸溶液并混勻，在37℃下放置30 min，最后在510 nm波長處測其吸光度值。同時進行空白對照（Ac）和樣品對照（Aj）處理，按下式計算各測定樣品溶液對羥自由基（·OH）的清除率。

式中：Ai為樣品溶液加水楊酸溶液的吸光度值；Aj為樣品溶液與空白溶劑混合后的吸光值；Ac為水楊酸溶液與空白溶劑混合液的吸光值。

1.3.4.3 對ABTS+自由基的清除能力[15-16]

用2.45 mmol/L過硫酸鉀配制7 mmol/L ABTS溶液，配好的溶液在室溫避光放置16 h，然后將其用pH7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋，使其稀釋液在734 nm下吸光度值為0.70±0.02，取0.3 mL樣品溶液，再加入3.7 mL稀釋后的ABTS溶液，充分混合均勻后，室溫下避光放置20 min，734 nm處測定各樣品的吸光度值。按下式計算各待測樣品對ABTS+自由基的清除率。

式中：Ai為樣品溶液的測定值；A0為蒸餾水代替樣品溶液后的測定值。

1.3.4.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定[17]

取不同濃度的多糖溶液0.1 mL于試管中，以蒸餾水代替樣品溶液作空白，然后在各試管中分別加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）2.8 mL，充分混合混勻后在25℃下靜置保溫10 min，再加入3 mmol/L 25℃預熱的鄰苯三酚溶液0.1 mL，迅速混勻后在波長325 nm處測定各試管的吸光度值，每隔30秒讀取1次，5 min后結束，按下式計算多糖溶液對超氧陰離子自由基的清除率。

式中：V0為空白管的自氧化速率（ΔA/min）；VI為加入樣品的自氧化速率（ΔA/min）。

1.3.4.5 還原能力的測定[18]

取配制好的不同濃度的多糖溶液各1 mL，加入pH 6.6，0.2 mol/L磷酸緩沖液2.5 mL，再加入2.5 mL 1g/100mL的K3Fe（CN）6溶液，混合均勻后在50℃水浴中保溫20 min，然后冷水速冷，加入10 g/100 mL的三氯乙酸2.5 mL并混勻，3 000 r/min，離心10 min，取上清液1.5 mL，加入新配的0.1 g/100 mL FeCl3溶液0.2 mL，加入1 mL蒸餾水并混勻，蒸餾水調零，于700 nm處測定各樣品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 硒多糖純化組分成分分析

按照1.3.1中的方法對富硒平菇中的多糖進行提取，采取1.3.2中的方法進行分離純化，得到3個組分Se-POP-1，Se-POP-2，Se-POP-3，原粗多糖及各分離組分的總糖、總蛋白、糠醛酸、硫酸基、硒以及多酚的測定結果見表1。

表1 富硒平菇多糖純化組分組成Table 1 Chemical compositions of purified polysaccharide from P.ostreatus

經Sephadex G-100凝膠層析純化凍干后的多糖產物Se-POP-1和Se-POP-2呈純白色海綿狀，易溶于水，水溶液基本無色透明，Se-POP-3呈帶有微黃色的疏松絮狀，易溶于水，水溶液呈透明淺黃色。由表1分析可知，純化組分的總糖含量都較粗多糖有所提高，其中，Se-POP-1的總糖含量最高，達87.39%。3種分離組分仍有微量蛋白質檢出，可能是含有結合態糖蛋白，但其蛋白含量都較粗多糖降低。糖醛酸和硫酸基含量高于粗多糖，Se-POP-1中的含量高于Se-POP-2和Se-POP-3。3種組分中硒含量與粗多糖相比變化不大，而多酚含量較粗多糖降低，Se-POP-1中略高于Se-POP-2和Se-POP-3。

2.2 DPPH自由基清除率

DPPH的醇溶液呈深紫色并在517 nm處有一強吸收，當抗氧化物質存在時，DPPH自由基在接受抗氧化劑提供的電子或氫時被還原而使DPPH吸收逐漸降低，顏色變淺，褪色程度與其接受的電子數量成定量關系，從而可以反映抗氧化劑清除DPPH自由基的能力，其已被廣泛應用于評價各種抗氧化劑的自由基清除能力。不同濃度硒多糖組分對DPPH自由基清除率見圖1。

圖1 不同濃度硒多糖組分對DPPH自由基清除率Fig.1 Scavenging rate for DPPH radical of Se-POP components with different concentration

從圖1可知，不同濃度的富硒平菇多糖組分對DPPH自由基的清除率都隨著濃度的增加而增加，在相同濃度下清除率大小順序為Se-POP＞Se-POP-1＞Se-POP-2＞Se-POP-3，在6 mg/mL濃度時清除率分別為85.58%、82.16%、75.16%和55.73%，但都低于同濃度下VC的清除率99.56%，粗多糖清除率較高的原因可能是其中含有較多的多酚物質或其他的抗氧化成分如有機酸、微量元素及肽，與文獻[17]報道的結果一致，Se-POP-1組分清除率較高的原因與其中分子量大小及單糖組成有關，也可能與較高的含硒量有關。

2.3 羥自由基清除率

羥自由基是體內經常存在的自由基，其可以穿過細胞膜與生物大分子物質中的多糖、蛋白質、核酸、脂肪反應，造成機體損害和細胞的死亡，因而羥自由基被認為是對機體危害最大的自由基之一，因而評價抗氧化物質對羥自由基的清除率意義重大。不同濃度硒多糖組分對羥自由基清除率見圖2。

圖2 不同濃度硒多糖組分對羥自由基清除率Fig.2 Scavenging rate for hydroxyl free radical of Se-POP components with different concentration

從圖2可知，不同濃度的富硒平菇多糖組分對羥自由基的清除率都隨著濃度的增加而增加，在相同濃度下清除率大小順序為 VC＞Se-POP＞Se-POP-1＞Se-POP-2＞Se-POP-3，粗多糖及3種分離組分清除率分別從1 mg/mL時的63.35%、46.37%、41.42%、35.78%上升到6 mg/mL時的85.21%、76.16%、71.43%、56.16%，相同濃度下粗多糖Se-POP清除率高于其他分離成分，Se-POP-1高于其它組分。

2.4 ABTS+自由基清除率

ABTS+自由基屬于水溶性陽離子自由基，也被廣泛應用于評價各種抗氧化劑清除自由基的能力。不同濃度硒多糖組分對ABTS+自由基清除率見圖3。

圖3 不同濃度硒多糖組分對ABTS+自由基清除率Fig.3 Scavenging rate for ABTS+radical of Se-POP components with different concentration

從圖3可知，不同濃度的富硒平菇多糖組分對ABTS+自由基的清除率都隨著濃度的增加而呈線性上升的趨勢，濃度低于3 mg/mL時幾種多糖組分對ABTS+自由基的清除率差異不大，當濃度大于3 mg/mL時粗多糖的清除率顯著高于其它幾種組分（P＜0.05），Se-POP-1的清除率又高于Se-POP-2和Se-POP-3，但差異不顯著（P＞0.05）。同濃度下VC的清除率仍然最高。

2.5 超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基是由多種生物反應和光化學反應產生的一種相對較弱的氧化劑[19]，超氧陰離子自由基不會直接誘導生物體體系的脂類產生氧化，但是其會分解形成更強的活性氧物質，如單線態氧和·OH，引起脂質過氧化。而且O2·-會在金屬離子的作用下發生Fenton反應，生成具有高活性的·OH，從而間接的引發脂質過氧化[20-21]，因此常用對O2·-的清除能力來評價天然產物的抗氧化活性。不同濃度硒多糖組分對超氧陰離子自由基清除率見圖4。

圖4 不同濃度硒多糖組分對超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Scavenging rate for Superoxide anion radical of Se-POP components with different concentration

從圖4可知，不同濃度的富硒平菇多糖組分對超氧陰離子自由基的清除率都隨著濃度的增加而增加，在相同濃度下粗多糖清除率高于其他分離成分，在濃度為6 mg/mL時清除率都達到最大值，VC的清除率在2 mg/mL時達到最大值99.56%。文獻報道結合硒的多糖對超氧陰離子自由基的清除率活性較強，硒多糖中存在的硒酸酯是促進抗氧化效果的主要因子，可能的原理是此基團改變了硒多糖中的三維結構同時增加了羥基的數量，也可能與硒本身具有的抗氧化性有關[22]。

2.6 還原力

物質通過給自由基提供電子后使自由基變為穩定的分子進而發揮抗氧化作用，還原力是綜合評價抗氧化物質提供電子能力的重要指標之一。大量研究證明還原力與抗氧化活性之間存在正相關，一般還原力即OD700值越大，其抗氧化效果越強，因而通過還原力的數值可以綜合評價一種物質的抗氧化效果強弱。不同濃度硒多糖組分的還原力見圖5。

從圖5可知，不同濃度的富硒平菇多糖組分的還原力都隨著濃度的增加而緩慢上升，在相同濃度下粗多糖的還原力值仍然最大，但低于VC的還原力值。大小順序為 VC＞Se-POP＞Se-POP-1＞Se-POP-2＞Se-POP-3，在 6 mg/mL 濃度時 OD700值分別為 2.59、0.772、0.635、0.455和0.367。

圖5 不同濃度硒多糖組分的還原力Fig.5 Reduce power of Se-POP components with different concentration

3 結論

從富硒平菇中提取得到的硒多糖，經分離純化后得到 3 個組分 Se-POP-1、Se-POP-2、Se-POP-3，不同的硒多糖組分對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率都隨著濃度的增加而增大，但都低于同濃度下VC的清除率，粗多糖的清除率高于各分離組分，3種分離組分對自由基清除率的大小順序為：Se-POP-1＞ Se-POP-2＞ Se-POP-3，這與3種組分的分子量大小、單糖組成及糖鏈的結構不同有關，同時與其不同的硒、多酚含量也有關。

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