海靈菇酪氨酸酶超聲波輔助萃取工藝研究

彭嘉璇，高明會，姜茜茜，陳新峰，鐘寶

（吉林農業科技學院食品工程學院，吉林吉林132101）

海靈菇產自遠洋深海，因其形似菇，故取名海靈菇。屬綠色無污染的軟體動物。海靈菇體厚、肉質堅實、光亮平滑，可食用，味道鮮美，營養豐富。

酪氨酸酶（tyrosinase）又名陳干酪酵素、多酚氧化酶、兒茶酚氧化酶等，是一種含銅氧化還原酶，廣泛存在于動植物、微生物和哺乳動物中，是兒茶酚胺黑色素合成的關鍵酶，其加氧和氧化雙重功能可增強生物體表面機械強度，并在外來物入侵時獲得免疫反應過程中有重要作用[1-3]。酪氨酸酶對底物（羧酸及其衍生物、苯胺及其衍生物、酚類及其衍生物及其他非酚類等）都具有較強的催化降解能力，近年來，酪氨酸酶被廣泛用于食品加工、醫學、美容、生物傳感器、環境保護、染料脫色等方面的研究[4-5]。

海靈菇含有酪氨酸酶，對降低血壓有明顯效果。中醫認為，海靈菇有滋陰養胃、補虛潤膚之功能。同時，酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵酶，可能是白癜風自身免疫的重要抗原。最近發現部分白癜風患者血清中有酪氨酸酶抗體，且與白癜風臨床類型和分期密切相關。自身免疫性白癜風發病機制與酪氨酸酶的抗體水平有關，為其免疫治療提供依據[6-7]。

國內主要利用海靈菇制作菜肴和小吃，關于海靈菇的相關研究未見報道，因此加強對其研究，對獲得低成本、來源廣泛的酪氨酸酶及其相關性質的研究具有重要的經濟和理論意義。本試驗以海靈菇為原料，利用超聲波時間短、效率高、耗能低的特點進行萃取，以酪氨酸酶的得率為最終的評價指標[8-15]，在超聲功率、超聲時間、超聲溫度3個單因素試驗的基礎上，結合響應面法優化工藝條件，從而得到最佳的酪氨酸酶萃取工藝參數，為后期開發利用海靈菇酪氨酸酶和工業化生產酪氨酸酶提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料

鮮海靈菇：日照漁貝爾食品有限公司；磷酸鈉緩沖溶液（純度≥99.99%）：鞍山潤生物資有限公司；聚乙烯吡咯脘酮（純度≥99.99%）：北京康普匯維科技有限公司；硫酸銨（分析醇，純度≥99.99%）：天津試劑廠。

1.1.2 試驗儀器

UV-2802S紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；TB-214電子分析天平、PE20K酸度計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；JYL-Y99料理機：九陽股份有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；BCD-206STA海爾冰箱：海爾集團股份有限公司；DIRECT-Q3超純水器：美國密理博公司；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SCIENTZ－ⅡD超聲波細胞破碎儀：寧波新芝超聲設備有限公司；R-215旋轉蒸發儀：瑞士步琪公司；SHB-III循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 工藝流程及操作要點

1.2.1 工藝流程

原料→預冷凍→緩沖液→打漿→過濾→硫酸銨→超聲處理→離心→傾出上清液→硫酸銨→超聲處理→離心→沉淀→定容

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 制取海靈菇勻漿濾液

將預先冷藏過的海靈菇，準確稱量100 g，加入100 mL預冷磷酸鈉緩沖溶液和2 g聚乙烯吡咯脘酮，多次間歇性勻漿。勻漿后，倒出海靈菇混合物，雙層紗布過濾，用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液沖洗紗布，收集濾液，棄殘渣物質。

1.2.2.2 超聲波萃取

加入研磨細的硫酸銨，使達到10%飽和度，采用超聲波進行處理。將濾液分裝至50 mL離心管內，3 800 r/min，離心15 min，棄掉上清液；繼續加入研磨細的硫酸銨，使達到70%飽和度，采用超聲波進行處理。將濾液分裝至50 mL離心管內，3 800 r/min，離心20 min，棄掉上清液。取出沉淀定容于250 mL容量瓶，待用。

2 結果與分析

2.1 海靈菇酪氨酸酶超聲波輔助萃取單因素試驗結果與分析

2.1.1 不同超聲功率對酪氨酸酶得率的影響

分別量取15 mL待測溶液于5個量筒中，加入研磨細的硫酸銨，使其達到10%的飽和度。用玻璃棒攪拌均勻，置于超聲波細胞破碎儀中，在超聲時間為30 min，超聲溫度為40℃的條件下，分別選取70、80、90、100、110 W的超聲波功率，進行提取，測量不同功率條件下所得提取液的酪氨酸酶的得率。結果見圖1。

圖1 超聲波功率對酪氨酸酶得率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic power on the rate of tyrosinase

由圖1可知，超聲功率的變化范圍在70 W～110 W內，酪氨酸酶的提取率先增大后減小，在功率為90 W時達到最大值，功率過高，會破壞酪氨酸酶的結構，使其有效的成分融入提取劑中，使得提取率降低。

2.1.2 不同超聲時間對酪氨酸酶得率的影響

分別量取15 mL待測溶液于5個量筒中，加入研磨細的硫酸銨，使其達到10%的飽和度，用玻璃棒攪拌均勻，置于超聲波發生器中，在超聲波功率為90 W，超聲溫度為40℃的條件下，分別選取10、20、30、40、50 min的超聲時間，進行提取，測量不同時間條件下所得提取液的酪氨酸酶的得率。結果見圖2。

圖2 超聲時間對酪氨酸酶得率的影響Fig.2 The effect of ultrasound time on the rate of tyrosinase

由圖2可知，在超聲功率為90 W，超聲溫度為40℃的情況下，超聲時間變化范圍在10 min～50 min內，酪氨酸酶的提取率先增高后保持不變，在超聲時間為30 min時達到最大值，時間過短時，酪氨酸酶還沒有充分被提取，但由于功率保持不變，所以當達到最適時間后，酪氨酸酶的得率幾乎沒有變化。

2.1.3 不同超聲溫度對酪氨酸酶得率的影響

分別量取15 mL待測溶液于5個量筒中，加入研磨細的硫酸銨，使其達到10%的飽和度。用玻璃棒攪拌均勻，置于超聲波發生器中，在超聲波功率為90 W，超聲時間為30 min的條件下，分別選取30、35、40、45、50℃的超聲溫度，進行提取，測量不同溫度條件下所得提取液的酪氨酸酶的得率。結果見圖3。

圖3 超聲溫度對酪氨酸酶得率的影響Fig.3 The effect of ultrasound temperature on the rate of tyrosinase

由圖3可知，酪氨酸酶的最適溫度在40℃左右，所以溫度過低時，沒能激活酶的活性，當超聲處理溫度過高時，使酪氨酸酶致死，失去活性，因此酪氨酸酶的得率會下降，只有在40℃左右（最適溫度）時，酪氨酸酶的得率最高。

2.2 響應面法優化海靈菇酪氨酸酶工藝條件

2.2.1 響應面試驗

根據Box-Behnken設計原理和單因素試驗結果，以超聲波功率、超聲時間、超聲溫度為因素，以酪氨酸酶提取率為響應值，設計三因素三水平的響應面優化試驗，每一組試驗設計兩個重復，計算其平均值，結果見表1。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Response surface analysis factor and level table

根據單因素，進行三因素三水平的響應面分析，安排17組處理組合，考察超聲功率A，超聲時間B，超聲溫度C，對海靈菇酪氨酸酶得率R1的影響（具體見表2）。

表2 海靈菇酪氨酸酶響應面試驗設計與結果Table 2 Tyrosinase response surface test design and results

2.2.2 海靈菇酪氨酸酶回歸模型、方差分析及顯著性檢驗

采用Design-Expert8.0.6軟件對表2進行多元回歸模型擬合、方差分析及顯著性檢驗。得到初步回歸方程為：R1=+1.70+0.11A+0.23B+0.27C-0.19AB-0.1AC+0.23BC-0.19A2-0.74B2-0.23C2

對該模型進行顯著性檢驗，可得到方差分析見表3，模型的可信度分析見表4。

由表3、表4可知，模型的P值小于0.000 1，遠小于0.01，說明該模型極顯著，實際的測定值與回歸模型的設計可以最大限度擬合，試驗的誤差比較小，所以，能夠用該回歸方程來代替試驗的真實值對試驗結果進行分析，得到R2=97.85%，預測值與實測值之間存在著較高相關性，也就說明該方程具有比較高的可靠性。該回歸模型中，一次項、交互項、二次項中，都表現出了極顯著水平或顯著水平。方差分析結果還表明，影響酪氨酸酶得率的因素為超聲溫度C＞超聲時間B＞超聲功率A。

表3 回歸方程ANOVA分析表Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

2.3 各因素交互作用對酪氨酸酶得率的影響面分析

在回歸模型方差分析結果的基礎上，利用軟件做超聲功率、超聲時間、超聲溫度影響的等高線和響應面圖，結果如圖4、圖5、圖6所示。

圖4 超聲功率、超聲時間對酪氨酸酶得率影響的等高線和響應面Fig.4 Contour and response surface of the effect of ultrasonic power and ultrasonic time

圖5 超聲功率、超聲溫度對酪氨酸酶得率影響的等高線和響應面Fig.5 Contour and response surface of the effect of ultrasonic power and ultrasonic temperature on the rate of tyrosinase

圖6 超聲時間、超聲溫度對酪氨酸酶得率影響的等高線和響應面Fig.6 Contour and response surface of the effect of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the rate of tyrosinase

2.4 酪氨酸酶的率優化工藝參數驗證

為進一步確定最佳參數，對擬合的回歸方程求分別一階偏導數，并設其為0，得到三元一次方程如下：

求解得：A=90，B=30，C=40 即最佳組合為：超聲功率為90 W，超聲時間為30 min，超聲溫度為40℃。對工藝參數進行3次驗證試驗，制得酪氨酸酶得率的平均值為1.70%，與理論的預測值比較接近，表明該響應面所得到的數學模型是可靠的模型，具有一定的應用價值。

3 結論

本試驗以海靈菇為原料，研究超聲波輔助萃取海靈菇酪氨酸酶的工藝，在萃取過程中，對超聲功率、超聲時間、超聲溫度等因素進行分析，并通過響應面法進一步優化試驗工藝參數，所得的數據表明，超聲溫度C＞超聲時間B＞超聲功率A。

在單因素試驗的基礎上，運用響應面對海靈菇酪氨酸酶的提取條件進行了優化，并建立了回歸模型方程，通過驗證表明該模型具有一定的合理性和可靠性。最終得到最佳釀制工藝參數為：超聲功率90 W，超聲時間30 min，超聲溫度40℃。酪氨酸酶的得率的平均值為1.70%。

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