鯖魚罐頭蒸煮液酶解制備抗氧化肽的工藝研究

畢丹丹，林娟，郭耀湘，葉秀云

（福州大學福建省海洋酶工程重點實驗室，福建福州350116）

隨著我國水產品總體產量的不斷提高[1]，水產品加工下腳料大量累積，據統計每年我國魚類加工中有近百萬噸蒸煮液亟待開發。由于缺乏有效的技術手段，目前企業對富含蛋白質的水產品加工蒸煮液利用很少，多數采用直接排放，這不僅造成資源的浪費，同時也對海洋和陸地環境造成污染[2-3]。因此對水產品加工廢棄液進行綜合開發利用，變廢為寶，生產出各種農業、醫藥、食品等行業所需的新產品，將大大降低主導產品的成本，產生較高的經濟、生態和社會效益[4-6]。

魚罐頭加工蒸煮液中蛋白的回收和加工能給企業帶來很高的直接經濟收益。研究表明，金槍魚蒸煮液中蛋白含量達4%，每年臺灣省光金槍魚罐頭加工所產生的蒸煮液中就至少含有400 t優質蛋白[7-10]。魚類加工蒸煮液中的蛋白是生物活性肽的優質來源，水產蛋白源生物活性肽具有多種生理功能。因此回收蒸煮液蛋白，酶解蛋白制備生物活性肽，有助于魚類加工企業實現廢棄液的環保化、高值化開發，延長魚類加工企業產業鏈，提升企業的競爭力，促進產業升級，為低碳經濟發展作貢獻[11-13]。

1 材料與方法

1.1 原料

鯖魚罐頭蒸煮液由福州百洋海味食品有限公司提供。

1.2 主要試劑

風味蛋白酶（26 806 U/g，60℃，pH6）、胰蛋白酶（125 305 U/g，45 ℃，pH7）、堿性蛋白酶（121 847 U/g，50 ℃，pH9）、中性蛋白酶（52 043 U/g，45 ℃，pH7）：南寧龐博生物科技有限公司；BSA牛血清蛋白：Sigma公司；其余常用試劑均為分析純。

1.3 溶液配制

硼酸吸收液：將0.1 g甲基紅溶于100 mL無水乙醇，將0.1 g溴甲酚綠溶于100 mL無水乙醇。將二者以7∶10比例（體積比）混勻后，取出8.5 mL與500 mL 2%硼酸溶液混勻。

Lowry法試劑：

a試劑甲：取10 g碳酸鈉，2 g氫氧化鈉和0.25 g酒石酸鉀鈉，溶解于500 mL蒸餾水中，即為A液；取0.5 g硫酸銅溶解于100mL蒸餾水中，即為B液。每次使用前，將A液與B液按50∶1（體積比）混合，即為試劑甲。

b試劑乙：市售Folin-酚試劑，使用時稀釋3倍；

1.4 主要儀器設備

KDN-103F型全自動凱氏定氮儀、HYP-3型高溫加熱爐：上海纖檢儀器有限公司；AE-6111型垂直電泳槽、AE-8150型電泳儀：日本ATTO公司；TP-114型分析天平：Denver instrument公司；MSC-300型中空纖維柱：上海摩速科學器材公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機：日本HITACHI公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 鯖魚罐頭蒸煮液的濃縮處理

將鯖魚罐頭蒸煮液采用10 kDa中空纖維膜進行超濾濃縮，蛋白濃縮倍數為2.5倍。

1.5.2 鯖魚罐頭蒸煮濃縮液基本成分的測定

1.5.2.1 水分和灰分的測定

水分和灰分的測定采用恒溫干燥法[14]。

1.5.2.2 總蛋白質的測定

總蛋白質的測定采用凱氏定氮法[15]。

1.5.2.3 可溶性蛋白含量測定

可溶性蛋白含量測定采用Lowry法（Folin-酚）。

1）Folin-酚標準曲線的繪制

往各試管中分別加入 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL250 μg/mL的標準蛋白質溶液，用蒸餾水補足1.0 mL；然后每支試管加入5 mL試劑甲，迅速混合，室溫放置10 min后逐管加入0.5 mL試劑乙（folin-酚試劑），迅速混勻（快速混合，以免造成試驗結果不準確）；室溫放置30 min，以未加入蛋白質溶液的試管為空白對照，在700 nm處測定各管中的吸光值OD700。以BSA濃度為橫坐標，以OD700為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of BSA

2）樣品測定

將樣品溶液適當稀釋后，在相同條件下按照上述標準曲線制作步驟測定OD700，根據標準曲線計算樣品溶液中的可溶性蛋白含量。

1.5.2.4 脂肪的測定

脂肪的測定采用索式抽提法。

1.5.3 羥自由基清除能力的測定

羥自由基清除能力的測定參考李春美等[16]的方法，略有修改。

在試管中，依次加入0.5 mL不同濃度的樣品，2.0 mmol/L FeSO41.5 mL，6 mmol/L H2O21.5 mL 和6.0 mmol/L水楊酸1.5 mL，搖勻。于37℃反應30 min后取出，流水冷卻，于波長510 nm下測定吸光值，以蒸餾水為空白對照，同時以抗壞血酸（VC）為陽性對照，所有試驗設置3組平行。其對羥自由基清除率按以下公式計算：

羥自由基清除率/%=[1－（H1－H2）/H0]×100

式中：H0為未加清除劑的吸光值；H1為加入清除劑的吸光值；H2為試劑空白的吸光值。

1.5.4 各蛋白酶水解效果比較

由于不同蛋白酶水解作用的位點不同，其水解產物的抗氧化活性也不同。在相同的蛋白酶添加量5 000 U/g下，在酶各自的最適作用條件下反應，以羥自由基清除率為指標，比較不同蛋白酶的水解效果，選擇出用于酶解蒸煮液的蛋白酶。

1.5.5 蛋白酶對蒸煮液的酶解條件單因素試驗

以羥自由基清除率為指標，對選擇的兩種蛋白酶進行添加量、反應溫度、反應pH值、反應時間進行單因素試驗，優化酶解條件。

1.5.6 蒸煮液酶解條件響應面試驗

以單因素試驗的結果為基礎，設計酶添加量、反應溫度、反應pH值的響應面試驗，以羥自由基清除率為指標，分析各因素的顯著性，并建立數學模型，預測選擇的兩種蛋白酶酶解蒸煮液的最優條件。

1.5.7 復合蛋白酶酶解工藝比較

由于蛋白酶對肽鍵作用具有專一性，不同酶的酶切位點不同，可以互補，進而有效增大底物的水解程度，同時暴露出更多的活性氨基酸殘基[8]。根據選擇的兩種蛋白酶酶解蒸煮液的最優條件，分別根據復配酶解（即把兩種需要的蛋白酶以一定配比混合在一起進行酶解）和分段酶解（即把兩種需要的蛋白酶以分段形式按時間先后添加進行酶解）設計4種復合蛋白酶酶解方案。以羥自由基清除率為指標，比較各方案的水解效果，獲得最優的復合酶解工藝。

2 結果與討論

2.1 鯖魚罐頭蒸煮液蛋白分子量分布及濃縮液基本成分測定

利用SDS-PAGE分析鯖魚罐頭蒸煮液中蛋白質分子量分布，結果如圖2所示。

圖2 鯖魚罐頭蒸煮液蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-Page of the cooking liquid of canned of mackerel

可以看出，鯖魚罐頭蒸煮液中蛋白質分子量主要分布在20.1 kDa以上，因此可以采用10 kDa中空纖維膜進行蒸煮液蛋白的濃縮制備。

對濃縮后的蒸煮液進行成分分析，結果如下：水分含量91%，粗蛋白質含量0.16%，脂肪含量0.16%，灰分1.17%。

2.2 蛋白酶的選擇

各蛋白酶酶解蒸煮液產物的羥自由基清除率如圖3所示。

圖3 4種蛋白酶的羥自由基清除率隨反應時間的變化曲線Fig.3 Curves of hydroxyl radical scavenging activity of different reaction time by four proteases

可以看出，堿性蛋白酶酶解產物的羥自由基清除效果最好，反應3 h后產物的羥自由基清除率可達31%；胰蛋白酶次之，反應時間4 h后產物的羥自由基清除率為16%。所以后續選擇堿性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解工藝進行深入研究。

2.3 酶解蒸煮液條件的單因素分析

2.3.1 堿性蛋白酶酶解蒸煮液條件

在反應溫度為50℃，反應pH值為9，反應時間為3 h的條件下，酶添加量對于酶解產物的羥自由基清除率影響如圖4所示。

圖4 堿性蛋白酶添加量對羥自由基清除率的影響Fig.4 Effects of alcalase addition on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，隨著酶添加量的增加，羥自由基清除率先增加后減小。羥自由基清除率在酶添加量為7 000 U/g時達到最大。

在酶添加量為7 000 U/g，反應pH值為9，反應時間為3 h的條件下，反應溫度對于酶解產物的羥自由基清除率影響如圖5所示。

圖5 反應溫度對羥自由基清除率的影響Fig.5 Effects of reaction temperature on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，在一定的范圍內，隨著溫度的增加，酶解液的羥自由基清除率呈現增長的趨勢，在60℃達到最大值。

在酶添加量為7 000 U/g，反應溫度為60℃，反應時間為3 h的條件下，不同反應pH值對酶解產物羥自由基清除率的影響如圖6所示。

圖6 反應pH值對羥自由基清除率的影響Fig.6 Effects of reaction pH on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率隨著反應pH值的增大呈現先增后減的趨勢，在pH 8.5時達到最大值。

在酶添加量為7 000 U/g，反應溫度為50℃，反應pH值為8.5，不同反應時間對酶解產物羥自由基清除率的影響如圖7所示。

可以看出，隨著反應時間的延長，羥自由基清除率呈現出一個緩慢的增長再下降的趨勢。在反應3 h，對應水解液羥自由基清除率達到最高，與圖3測定的結果一致，所以取3 h為堿性蛋白酶酶解反應時間。

2.3.2 胰蛋白酶酶解蒸煮液條件

在反應溫度為45℃，反應pH值為7，反應時間為4 h條件下，不同酶添加量對酶解產物羥自由基清除率的影響如圖8所示。

圖7 反應時間對羥自由基清除率的影響Fig.7 Effects of reaction time on hydroxyl radical scavenging activity

圖8 胰蛋白酶酶添加量對羥自由基清除率的影響Fig.8 Effects of trypsin addition on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率先隨著酶添加量的增加而增大，在酶添加量為7 000 U/g時達到最大。

在酶添加量為7 000 U/g，反應pH值為7，反應時間為4 h條件下，不同反應溫度對酶解產物羥自由基清除率的影響如圖9所示。

圖9 反應溫度對羥自由基清除率的影響Fig.9 Effects of reaction temperature on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率隨著溫度的增加先增大后減小，在55℃時達到了最大。

在酶添加量為7 000 U/g，反應溫度為45℃，反應時間為4 h條件下，不同反應pH值對酶解產物羥自由基清除率的影響如圖10所示。

圖10 反應pH值對羥自由基清除率的影響Fig.10 Effects of reaction pH on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率隨著反應pH值的增加而增大，在pH7.0時達到最大值，而后緩慢下降。

在酶添加量為7 000 U/g，反應溫度為45℃，反應pH值為7，不同反應時間對酶解產物羥自由基清除率的影響如圖11所示。

圖11 反應時間對羥自由基清除率的影響Fig.11 Effects of reaction time on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，當反應時間為4 h時，羥自由基清除率達到最大值，與圖3測定結果一致，所以選取4 h為胰蛋白酶酶解反應時間。

2.4 酶解蒸煮液條件的響應曲面分析

2.4.1 堿性蛋白酶

在單因素試驗結果（酶添加量7 000 U/g，反應溫度50℃，反應pH 8.5，反應時間3 h）的基礎上，通過響應曲面法設計試驗，對堿性蛋白酶酶解條件進一步優化。響應曲面試驗各因素水平及編碼見表1。

設計及結果如表2所示。

表1 響應曲面試驗設計試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM experiments

表2 響應曲面試驗方案及結果Table 2 Design matrix and the corresponding results of RSM experiments

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗數據進行二次多項回歸擬合，得到二次多項式回歸方程：

對模型進行方差分析，如表3所示。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

續表3 方差分析表Continue table 3 Analysis of variance table

模型P值小于0.000 1，說明模型效應顯著；失擬項P=0.347 0大于0.05，表明方程對實驗的擬合程度比較好。其中 X1，X3，X1X2，X1X3，X12，X22和 X32項對羥自由基抑制率有顯著影響；X2項（即pH值）對回歸方程的影響不顯著，而其對應的平方項影響顯著，說明實驗選取的pH值水平已經較好地接近于最優解附近的曲面中心區域。由各項的F值可知，各個因素對羥自由基清除率的影響程度依次為：反應溫度＞酶添加量＞pH值。

為驗證模型預測的可靠性，在最優條件下進行反應，進行3次平行試驗，得到羥自由基清除率平均值為39.53%，與預期值（39.59%）的相對誤差很小，說明了優化試驗結果的可靠性。

利用已建立的數學模型對反應溫度、pH值、酶添加量等條件進行優化，得出：反應溫度58.59℃，反應pH8.45，酶添加量為6 752.46 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為39.59%。

2.4.2 胰蛋白酶

在單因素試驗結果（酶添加量7 000 U/g，反應溫度45℃，反應pH 7，反應時間4 h）的基礎上通過響應曲面法設計試驗，對胰蛋白酶酶解條件進一步優化。響應曲面試驗各因素水平及編碼見表4。

表4 響應曲面試驗設計試驗因素水平表Table 4 Factors and levels of RSM experiments

響應曲面試驗設計及結果如表5所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗數據進行二次多項回歸擬合，得到二次多項式回歸方程：

表5 響應曲面試驗方案以及結果Table 5 Design matrix and corresponding results of RSM experiments

對模型進行方差分析如下表6所示。

模型P值小于0.000 1，模型效應顯著；失擬項P=0.203 6大于0.05，表明方程對試驗的擬合程度比較好。其中 X1，X3，X12，X22，X32對羥自由基抑制率有顯著影響；一次項X2即為pH值對回歸方程的影響不顯著，但是其對應的平方項則影響顯著，說明該因素所取的試驗水平，整體已經較好地接近最優解附近的曲面中心區域。根據各項的F值可知，單因素影響程度分別是：酶添加量＞反應溫度＞pH值。

為驗證模型預測的可靠性，在最優條件下進行反應，進行了3次平行試驗，得到的羥自由基清除率平均值為19.83%；與預期值（19.94%）的相對誤差很小，說明了優化試驗結果的可靠性。

利用已建立的數學模型對反應溫度、pH值、酶添加量等條件進行優化，得出：反應溫度為54.48℃，反應pH7.12，酶添加量為7 450.54 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為19.94%。

2.5 復合蛋白酶酶解工藝研究

根據上述兩個單酶的響應曲面試驗可以確定，無論是堿性蛋白酶還是胰蛋白酶，在單酶酶解過程中影響作用都是反應溫度＞反應pH值；所以在設計復合酶酶解試驗時，統一反應pH值，而在不同的反應階段，改變兩種蛋白酶的酶解反應溫度。

根據單酶響應曲面的優化結果，堿性蛋白酶的反應溫度設為59℃，而胰蛋白酶的反應溫度設為55℃，反應pH值統一設定為pH 8。

根據獲得堿性蛋白酶和胰蛋白酶解蒸煮液的最有條件，設計的4種復合酶反應體系如表7所示。酶解產物的羥自由基清除率如圖12所示。

表7 不同復合酶酶解反應體系Table 7 Experiments for different kinds of compound proteases

圖12 復合酶組合反應對羥自由基抑制率的影響Fig.12 Effects of mixed proteases on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，試驗方案4（先添加胰蛋白酶，反應時間4 h，反應pH8，反應溫度55℃；再添加堿性蛋白酶，反應時間3 h，反應pH8，反應溫度59℃。）的效果最好：即先添加胰蛋白酶進行反應，酶添加量7 450.54 U/g，溫度55℃，pH 8，反應時間4 h；再添加堿性蛋白酶進行反應，酶添加量6 752.46 U/g，溫度59℃，pH 8，反應時間3 h。其對應的羥自由基清除率高達61%，比堿性蛋白酶單酶水解結果39.53%提高了21.47%，比胰蛋白酶單酶水解結果19.83%提高了40.17%，而且要高于堿性蛋白酶單酶）和胰蛋白酶單酶的測定結果疊加之和。由此可見，使用復合酶酶解能夠實現酶切位點的互補，得到更多具有生物活性的肽段，進一步提高水解液的抗氧化活性。

3 結論

1）采用SDS-PAGE方法測定鯖魚罐頭蒸煮液中的蛋白分子量主要分布在20.1 kDa以上，選擇10 kDa的中空纖維膜對蒸煮液蛋白進行濃縮，相比于蒸煮原液的1%蛋白含量，濃縮后蛋白含量提高了4倍。

2）以羥自由基清除率為指標，對風味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果進行比較，得出胰蛋白酶、堿性蛋白酶的水解效果較好。

3）以羥自由基清除率為指標，對堿性蛋白酶的酶解工藝進行單因素優化試驗，再采用響應曲面實驗設計對堿性蛋白酶的酶解工藝進行進一步優化，得出最佳條件為：反應溫度58.59℃，反應pH8.45，酶添加量為6 752.46 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為39.59%。

4）以羥自由基清除率為指標，對胰蛋白酶的酶解工藝進行單因素優化實驗，再采用響應曲面試驗設計對胰蛋白酶的酶解工藝進行進一步優化，得出最佳條件為：反應溫度為54.48℃，反應pH7.12，酶添加量為7 450.54 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為19.94%。

5）根據響應曲面的影響因素大小關系，設計出胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復合酶解反應條件，得出復合分段酶解的效果最好。最佳的工藝條件為：先添加胰蛋白酶進行反應，溫度為55℃，酶添加量為7 450.54 U/g，反應pH為8，反應時間為4 h；而后添加堿性蛋白酶進行反應，酶添加量為6 752.46 U/g，溫度為59℃，反應pH為8，反應時間為3 h。其對應的羥自由基清除率達到了61%。

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