褐色發酵乳飲料發酵劑的篩選及復配

劉紅霞，烏云，高增麗，楊永龍，劉彥紅，曹文慧，孫濤，李洪亮，母智深

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，內蒙古呼和浩特011500）

伴隨著中國經濟的飛速發展，人們的消費水平得到大幅提高，對食物的口味和營養要求也越來越高。酸奶的口感、風味、營養及健康功能越來越被消費者追捧[1]。酸奶產量以年平均25%的速度增長，已經成為我國第一大發酵乳制品，是最具盈利和發展潛力的產業[2-3]。

近年來，褐色乳飲料因具有抑制腫瘤、抗氧化、抗衰老等多種生理功效及良好風味而風靡世界，生產量逐年攀升，越來越受消費者青睞[4]。褐色乳飲料是以發生輕微褐變的發酵乳為基料，再經稀釋、調配等工藝生產的呈淺褐色的乳酸菌飲料，以其特有的風味和色澤吸引消費者[5]。

國外相關的類似加工技術的產品有日本的養樂多，俄羅斯的格瓦斯，養樂多產品是采用牛奶中的蛋白質和葡萄糖經過美拉德反應，接種乳酸菌發酵再調配的一種乳飲料[6-7]。格瓦斯則是面包屑接種酵母菌、乳酸菌發酵的一種生物飲品[8]。國內褐色乳飲料主要有蒙牛優益C和伊利的每益添等產品，產品的加工過程與日本的養樂多產品相似，也取得了良好的銷售成績。

目前，市場上的褐色發酵乳飲料，發酵劑基本選擇干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌為基礎發酵菌種，發酵的時間基本在72 h以上。為提高褐色發酵乳飲料生產效率，在基本不影響傳統發酵風味的前提下縮短發酵時間，需要進行菌株的篩選和復配，發酵時間控制在40 h～50 h 范圍內，發酵奶酸度達到 230 °T～280 °T，pH值達到3.20～3.65。提高褐色乳飲料發酵速率，對于生產效率和降低能耗具有較好的理論及實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

L.h1、L.h2和L.h3為瑞士乳桿菌，Lb46為乳酸乳球菌乳脂亞種，以上菌種均從新疆樣品中自行分離并經過生理生化及分子生物學鑒定，副干酪乳桿菌Lpc-37：杜邦公司提供，菌株發酵特征見表1。

表1 菌株發酵特性Table 1 The bacterial fermentation characteristic

脫脂乳粉、葡萄糖和白砂糖蒙牛公司研發中心提供。發酵基料：10%脫脂乳+3%葡萄糖+5%白砂糖。

1.2 儀器與設備

AMS-Alliance乳品發酵監控儀：法國愛利安斯儀器公司；IKA EUROSTAR高速分散機：德國IKA；HITACHI CT6E離心機：日本日立；梅特勒MS603電子天平：瑞士梅特勒；均質機APV-1000：德國APV；LRH-250A生化培養箱：泰宏醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵試驗

1）檢測4株輔助發酵菌株的發酵特性，取適量乳基，巴氏殺菌（90℃～95℃，5 min～10 min），冷卻至43℃。依據試驗方案設置的接種量，靜置于43℃發酵。發酵過程中監測乳體系pH值變化情況，pH值接近4.5時即可停止發酵，取出，冷卻于4℃條件下后酸化12 h～24 h后，進行相關指標的測定，并進行感官品評。

2）依據單菌株發酵試驗結果設計復配方案。

1.3.2 檢測方法

1）發酵曲線：借助Cinac酸度監控儀檢測發酵樣品的pH值隨發酵時間的變化曲線。

2）感官品評：挑選25名發酵奶質檢人員（經常性進行酸奶感官評定培訓）對樣品進行品評[9]。發酵乳冷卻至4℃～8℃過夜，觀察和品嘗發酵樣品，記錄酸奶狀態。

3）酸奶酸度的滴定方法：取10 g酸奶放入250 mL三角瓶中，加入20 mL蒸餾水，再加入2滴～3滴0.5%的酚酞酒精溶液，小心搖勻，用濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，在30 s內不消失為宜。消耗濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫升數乘以 10，即為酸度°T。

4）發酵乳持水力測定[7]：準確稱取發酵乳樣品10 g置于離心管中，4 000 r/min離心10 min，稱重發酵乳上清（乳清），質量記為 n，g。持水力/%=（m-n）/m×100，其中m為發酵乳樣品質量，g[10-11]。試驗結果取3次重復測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 單菌株發酵酸奶的pH值變化情況和感官結果

2.1.1 單菌株發酵酸奶的pH值變化情況

4株輔助菌株單獨發酵的添加量及其發酵酸奶24 h pH值見表2，單菌株發酵酸奶pH值隨發酵時間的變化曲線如圖1所示。

表2 菌株添加量及其發酵酸奶24小時pH值Table 2 The strain content and the pH value of the fermented yogurt for 24 hours

由圖1可以看出，發酵乳的pH值呈現出平臺（延滯期）-迅速下降（對數生長期）-緩慢下降（穩定期）的變化趨勢。對比方案1和方案2，菌種添加量會影響發酵速度，發酵乳的pH值變化在延滯期和對數生長期出現較明顯的區別，增加瑞士乳桿菌L.h1的菌種添加量，可縮短延滯期，提高發酵速率，但隨著發酵時間的延長，終點pH值相差不大，所以從成本節約的角度考慮，應該選擇瑞士乳桿菌L.h1較低的添加濃度。

圖1 單菌株發酵酸奶pH值隨發酵時間的變化曲線Fig.1 The pH value of fermented yogurt with single strain changed with the fermentation time

單菌株的產酸速率各不相同，3支瑞士乳桿菌，只有L.h1發酵24 h可以把pH值降到3.60左右。3支瑞氏乳桿菌的添加量相同的情況下，L.h2的延滯期最短，發酵接近6 h后，pH值迅速下降，說明該階段菌體處于對數生長期，發酵接近16 h，pH值下降變緩，產酸速率降低，說明此時發酵已進入平穩階段（穩定期）。持續發酵24 h，終點pH值達到3.75。

3支瑞士乳桿菌，菌株L.h1的延滯期最長，發酵約8 h以內，L.h1的pH值下降最慢，發酵8 h以后，菌株L.h1發酵進入對數生長期，pH值迅速下降階段，發酵大約9 h左右，pH值下降速度趕超菌株L.h3，發酵接近13 h左右，菌株L.h1的pH值下降速度又趕超菌株L.h2，說明瑞氏乳桿菌L.h1在對數生長期產酸速度快，快速將發酵乳pH值降到最低。發酵24 h后，瑞氏乳桿菌L.h1、L.h2和L.h3發酵酸奶的pH值分別為3.60、3.75 和 3.70。

乳酸乳球菌Lb46發酵的延滯期較長，發酵大約9 h后進入對數生長期，pH值開始迅速下降，與3支瑞士乳桿菌相比，對數生長期pH值下降速度比較平緩，一直到發酵22 h，pH值下降明顯變緩，發酵進入穩定期，持續發酵24 h，終點pH值達到3.88。選擇乳酸乳球菌Lb46的目的是補充褐色酸奶快速發酵過程中損失的香味和酸奶質構，產酸速度不作為主要參考指標。

2.1.2 單菌株發酵酸奶的感官結果

發酵酸奶品嘗結果見表3。

由表3可以看出，乳酸乳球菌Lb46產酸速度慢，但發酵奶的風味和質構均比較理想，選擇乳酸乳球菌L46的目的就是改善發酵奶的風味和質構，這株菌滿足試驗需求和目的。3支瑞士乳桿菌，同等濃度添加量發酵奶，酸奶質構和發酵風味最好的是L.h2，其次為L.h1，L.h3的酸奶質構和風味均不理想，但是菌株L.h2產酸速度較慢，不能滿足產品菌種復配需求。所以選擇發酵速度最快的瑞士乳桿菌L.h1和產香菌株Lb46與基礎發酵菌株Lpc-37（副干酪乳桿菌）進行復配試驗，檢測發酵曲線、發酵奶的持水性和進行感官品評，以期確定單株瑞士乳桿菌L.h1對產酸和單株乳酸乳球菌Lb46對產香的影響程度，同時摸索出3株菌復配的理想比例，開發出提高褐色發酵乳飲料發酵效率的發酵劑。

表3 發酵酸奶品嘗結果Table 3 Fermented yoghurt tasted results

2.2 不同復配比例發酵乳的pH值變化情況和感官結果

優選出的3株乳酸菌復配方案見表4，菌種復配比例依據活力單位cfu/mL計算。

表4 菌種復配方案Table 4 Strain compounded scheme

2.2.1 不同復配比例發酵乳的pH值變化情況

不同復配方案發酵乳pH值隨發酵時間的變化曲線見圖2。

由復配方案和發酵曲線可以看出，方案1和方案3的區別在于觀察瑞士乳桿菌添加比例對發酵基料產酸速度的影響。在發酵40 h前，方案1的pH值下降速度明顯比方案3的速度慢，但隨著發酵時間的延長，40 h后，2個方案的發酵乳pH值隨發酵發酵時間下降的曲線基本重合，說明瑞士乳桿菌L.h1添加比例會影響發酵基料前期的產酸速度，但是隨著發酵時間的延長，發酵基料的pH值相近，發酵40 h后基本不影響發酵基料的終點pH值，綜合試驗結果和成本優化，選擇基礎發酵菌株Lpc-37和瑞士乳桿菌L.h1添加比例為100 ∶1。

圖2 不同復配方案發酵乳pH值隨發酵時間的變化曲線Fig.2 The pH value of fermented milk with different scheme changed with the fermentation time

方案4和方案5的試驗目的是對比乳酸乳球菌Lb46菌株添加比例對發酵速度的影響，由發酵曲線可以看出，從發酵開始到結束，這兩條曲線基本是重合的，說明Lb46菌株添加比例對發酵乳pH值下降速度影響不大。由方案6的發酵曲線可以看出，基礎發酵菌和乳酸乳球菌Lb46單獨復配不能滿足本次褐色乳飲料發酵劑復配目的，發酵終點pH值較高。對比方案1和方案2的發酵曲線，發現乳酸乳球菌Lb46會影響發酵基料前期的產酸速度，縮短發酵延滯期，加快產酸速度，同時可以補充發酵乳風味和質構。

2.2.2 不同復配比例發酵乳的持水力比較

不同復配比例發酵乳的持水力見圖3。

圖3 不同復配方案發酵乳的持水力Fig.3 The water retention of fermented milk of different scheme

乳清的析出主要受到發酵乳中酪蛋白分子重排和膠質鈣離子溶解速率的影響[12]，有研究表明，發酵乳中的一些大分子物質，例如胞外多糖，由于其具有較強結合水分的能力，并能和乳蛋白相互結合形成較穩定的網狀結構[13]，從而能夠有效地降低乳清的析出，提高發酵制品的感官品質和穩定性。利用重力和離心力是測定發酵乳持水性能的經典手段[14-15]。本研究采用離心測定析水力的方法分析了發酵乳的持水能力，結果如圖3所示，可以看出，方案1、方案2和方案6制備的發酵乳經離心后，持水力較高，說明乳清析出量較少，制成的發酵乳體系比較穩定。與之相比，方案3、方案4和方案5發酵乳的持水力較低，說明發酵乳上清析出量較高，同時也說明瑞士乳桿菌L.h1添加比例太高，會加快產酸速度，正是因為發酵速度快從而影響發酵乳的質構，更容易析水，發酵奶體系相對不穩定。由此可知，發酵劑菌株產酸的速率也會顯著影響乳清的析出，因此在復配發酵劑菌株時，應同時考慮菌株對發酵奶體系穩定性和發酵風味的影響。

2.2.3 不同復配比例發酵乳的終點pH值、滴定酸度和感官評價結果

不同復配比例發酵乳的終點pH值、滴定酸度和感官評價結果見表5。

表5 不同復配方案發酵乳的終點pH值、酸度和感官評價結果Table 5 The pH value，acidity and sensory evaluation results of fermentation milk of different scheme

綜合終點pH值、滴定酸度和品評結果，首先排除方案6，因終點pH值和滴定酸度不能滿足本次復配褐色發酵乳飲料發酵劑的試驗目的，同時發酵乳的風味也比較差；其余方案發酵乳的終點pH值和滴定酸度均滿足試驗需求，但是只有方案2發酵乳的發酵奶風味最好，滿足試驗需求，其余4個方案的發酵風味均不太愉快，所以從感官品評試驗結果選擇試驗方案2的復配比例。

復配比例不同，對發酵的酸奶的產酸速率、酸奶持水力（質構或穩定性）和發酵奶風味的影響程度不同。乳酸乳球菌Lb46與基礎菌株Lpc-37單獨復配，發酵乳的終點pH值、滴定酸度和發酵風味均不能滿足試驗需求；瑞士乳桿菌L.h1和基礎菌株Lpc-37單獨復配，發酵乳的終點pH值和滴定酸度可以滿足復配發酵劑對產酸要求，但發酵乳的持水力和發酵風味均不太理想；瑞士乳桿菌L.h1比例的增加，產酸速率明顯提高，酸奶的持水力和發酵風味均下降，所以，瑞士乳桿菌L.h1的復配比例不宜太高。

依據試驗結果，結合本次復配發酵劑的目的，基礎發酵菌株基礎菌株Lpc-37，需適量搭配產酸能力較強的瑞氏乳桿菌L.h1和產香乳酸乳球菌Lb46。綜合評價復配方案，2號方案比較理想，所以選擇基礎菌株Lpc-37、瑞士乳桿菌L.h1和乳酸乳球菌Lb46的復配比例為 100∶1∶2。

3 結論

試驗結果表明，可以通過菌種篩選和不同菌種間的合理復配提高褐色發酵乳飲料的發酵速度，進而提高產品的生產效率。

依據復配發酵劑試驗目的，結合不同菌種和菌株的發酵特性，合理選擇基礎發酵菌種副干酪乳桿菌Lpc-37，通過單菌株發酵實驗優選出水解能力較強的瑞氏乳桿菌L.h1，用以提高基礎發酵菌株Lpc-37的發酵速度，選擇產香菌株乳酸乳球菌Lb46，用以補充和改善因快速發酵產酸損失的褐色發酵奶特有的風味和質構。

依據試驗結果，提高褐色發酵乳的發酵速度，發酵時間控制在40 h～50 h，在不影響褐色發酵乳飲料特有的風味和同時兼顧發酵奶的穩定性的前提下，通過單菌株和復配菌株發酵試驗，優選出的發酵劑復配比例為：基礎菌株Lpc-37：瑞士乳桿菌L.h1：乳酸乳球菌Lb46為100∶1∶2。試驗結果顯示篩選和復配方案均比較理想，基本達到本次復配發酵劑的目的。

4 展望

隨著消費意識的逐步提高，酸奶等發酵制品的營養功效已被廣大消費者所認知。要生產出具有優良品質的發酵制品，不僅取決于產品的原料、加工工藝，更依賴于發酵劑本身的發酵特性。中國擁有年銷售額上百億的酸奶市場，但是酸奶發酵劑這一酸奶發酵的源頭卻掌握在西方國家的手里[16]。我國擁有豐富的乳酸菌資源，完全可以篩選和復配出更好的功能性生產菌株。通過借鑒國內外已有的理論成果和實踐經驗，利用國內豐富的菌種資源，篩選和復配自主知識產權的優良酸奶發酵劑，為公司生產具有企業特點和個性化的發酵乳制品奠定基礎和提供技術儲備。

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