兩種動物源性成分陽性質粒分子的構建與檢測方法的建立

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，各種美食豐富了人們的餐桌，潛伏的食品安全問題也隨之出現。其中，最值得關注的問題就是肉摻假問題，市場上許多不法商家以未經檢驗的貂肉冒充羊肉、牛肉摻入肉卷等事件層出不窮[1]，對日常監管和檢測能力都提出了新的挑戰。當前，分子生物學是檢測動物源性成分的重要手段[2]，聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術是通過熱循環對目的基因進行擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳分析，肉眼估算產物大小的一種檢測方法，這種檢測手段耗時較長，且溴化乙錠作為熒光染色劑具有一定的致癌性[3]，容易造成人為操作的誤差和環境污染。因此，熒光PCR技術憑借其省時、特異性強、靈敏度高、無污染等特點，被質檢部門廣泛的運用到日常檢驗工作當中，成為打擊不法商販，進而維護消費者合法權益的強有力手段[4]。

在利用熒光PCR技術對樣品進行檢測時，通常需要選取含有目的基因的陽性物質作為試驗對照，以確保試驗結果的準確性，由于有些陽性材料難獲取且有證標準物質具有價格昂貴、制作工藝復雜、有效期短等問題，影響了日常檢驗工作的開展[5]。為了解決陽性物質匱乏這一問題，眾多檢測機構都在研究用陽性質粒分子代替基體標準物質，用于動物源性成分的檢測。2002年，日本科學家Kuribara等首次提出陽性質粒分子這一概念[6]，陽性質粒分子就是重組質粒分子，具有易構建、純度高、繁殖快、成本低等優點，這種新型標準物質陽性質粒分子的出現，為動物源性成分的安全監管提供了陽性材料，緩解了由于標準物質缺乏造成的監管壓力。

為了解決摻假問題對食品業的影響，商品化食品檢測試劑盒作為一種新型快檢方法被廣泛應用到PCR分析當中，具有操作簡便、方法可靠、成本可控等特點，適合現場的快速檢測[7]。越來越多的機構投入到試劑盒的研發與生產中，也造成試劑盒質量良莠不齊的現象越來越明顯，使得試劑盒的檢驗質量得不到保證。針對以上問題，本研究構建了水貂、紫貂兩種成分的陽性質粒分子，并對其靈敏度和特異性進行了驗證，同時對比了3家公司引物、探針對熒光PCR反應效率的影響，擬研究出一種經濟、高效的實時熒光PCR反應體系，對于食品中動物源性成分準確可靠的鑒定具有重要意義和應用前景。

1 材料與方法

1.1 質粒的構建

根據設計的PCR引物，選擇水貂線粒體細胞色素b基因、紫貂16s rRNA基因引物對基因組DNA進行擴增，得到擴增序列，鏈接pUC57載體，構建相應陽性質粒DNA分子，序列合成由濟南博尚生物技術有限公司完成。

1.2 主要試劑

Premix Ex Taq HS 酶（0.05 U/μL）：Trkara公司；水貂、紫貂的引物和探針（見表1）分別由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon）、濟南博尚生物技術有限公司（Biosune）、寶日醫生物技術（北京）有限公司（Trkara）三家公司合成。

表1 實時熒光PCR檢測引物、探針Table 1 Specific primers and probes sequences in RT-PCR

1.3 主要儀器

QuantStudio7 Flex實時熒光PCR儀：美國ABI公司；NanoDrop 2000c生物紫外可見分光光度計：美國Thermo公司；5424R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；UV3 HEPA PCR反應工作臺：美國思博明科學器材公司。

1.4 實時熒光PCR檢測

實時熒光PCR反應體系：Premix Ex Taq HS酶12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探針（5μmol/L）1 μL，樣品 DNA（10 μg/mL～100 μg/mL）2.0 μL，加蒸餾水補足至25μL。實時熒光PCR反應參數為：95℃/10 s，1個循環；95℃/5 s，52℃/10 s，72℃/34 s，40個循環。試驗結果用QuantStudio7Flex實時熒光PCR儀進行分析，根據SN/T 3730.1-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第1部分：貂成分檢測實時熒光PCR法》[8]對結果的表述，當Ct值≤35時判定擴增結果為陽性。

2 結果與分析

2.1 陽性質粒分子檢測體系的驗證

2.1.1 特異性檢測

按照1.4的PCR反應體系，分別以水貂、紫貂陽性質粒分子為模板進行熒光PCR擴增，同時以水貂、紫貂提取的DNA作為陽性對照，以豬肉提取的DNA作為陰性對照，以滅菌水作為空白對照，對所構建的水貂、紫貂陽性質粒分子的PCR反應體系進行特異性驗證。檢測結果表明，兩種質粒分子和陽性對照均在40個循環內出現顯著擴增，陰性對照沒有信號，表明構建的兩種質粒具有良好的特異性，可以代替基因組作為陽性對照來使用（圖1）。

圖1 陽性質粒分子實時熒光PCR特異性檢測結果Fig.1 Real-time fluoresce quantitative specificity curve of positive plasmid molecule

2.1.2 靈敏度驗證

將水貂、紫貂陽性質粒分子進行10倍濃度梯度稀釋，從 100 ng/μL 稀釋至 10-5ng/μL，用梯度稀釋后的質粒做模板進行熒光PCR擴增，分別對靈敏度進行驗證，結果見圖2。

圖2 陽性質粒分子實時熒光PCR特異性檢測結果Fig.2 Real-time fluoresce quantitative sensitivity curve of positive plasmid molecule

通常認為，當Ct值≤35時，可判定被檢樣品為陽性，以能夠檢出樣品的最低濃度作為相應的檢出下限，由此可見，水貂、紫貂質粒分子的靈敏度檢出下限分別為10-4、10-3ng/μL，均具有較高的檢測靈敏度。

2.1.3 標準曲線的繪制

以X軸代表質粒拷貝數的對數，Y軸代表Ct值，繪制標準曲線（見圖3）[9]。

圖3 陽性質粒分子實時熒光PCR標準曲線Fig.3 Real-time fluoresce quantitative standard curve of positive plasmid molecule

根據圖3標準曲線可知，當質粒濃度從100 ng/μL～10-2ng/μL時，隨質粒稀釋度的增加，對應的Ct值也逐漸增大，且具有一定的梯度關系。兩個標準曲線的擴增效率分別為103.211%、98.834%，且相關系數R2均大于0.99，說明在模板濃度范圍內都具有很好的線性關系，可以用于樣品的定量分析。

2.2 不同公司引物探針對實時熒光PCR反應的影響

將水貂、紫貂陽性質粒分子進行10倍梯度稀釋，從 100 ng/μL 稀釋至 10-5ng/μL，選取 Sangon、Biosune、Trkara三家公司合成的引物、探針對各濃度模板分別進行實時熒光PCR反應，對其反應效果進行比較分析，結果見圖4～圖5。

檢測結果表明，使用3家公司合成的引物、探針對各濃度模板進行擴增時均可得到標準的S型擴增曲線，所有擴增曲線拐點清楚，指數增長期明顯，基線平穩無上揚[10]，且擴增曲線的重復性比較好，基線起峰范圍適當，Ct值隨模板濃度下降而下降[11]，不同的引物、探針所得到的檢出限略有不同。

如圖4 所示，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探針分別進行實時熒光PCR反應，水貂陽性質粒的靈敏度檢出限分別為 10-4、10-4、10-3ng/μL。顯然，Sangon與Biosune合成引物、探針的靈敏度檢出限與Trkara相比要高一個濃度梯度，且重復性和反應效率都略優于Trkara公司的DNA聚合酶。

由圖5 可知，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探針分別進行實時熒光PCR反應，紫貂陽性質粒的靈敏度檢出限分別為 10-3、10-2、10-1ng/μL。可見，Sangon公司合成引物、探針的靈敏度最高，且反應效率高于其他兩家公司。

圖4 3家公司引物、探針實時熒光PCR反應效果比較（水貂）Fig.4 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（mink）

圖5 3家公司引物、探針實時熒光PCR反應效果比較（紫貂）Fig.5 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（Martes zibellina）

3 結論

引物、探針的正確選擇是PCR反應成功的前提，高質量的引物、探針對PCR擴增效率具有很大的影響[12]。完成水貂、紫貂兩種陽性質粒分子的構建，發現這兩種質粒分子均具有靈敏度高、特異性強等特點，同時對PCR反應的關鍵技術指標-引物、探針進行驗證，發現Sangon公司合成的引物、探針的靈敏度略優于Biosune與TaKaRa公司。為進行熒光PCR反應時引物、探針的選擇提供一定的技術依據，為廣大食品企業及有關監管部門監測評價和控制動物制品的品質提供新的思路和有效手段，對于食品中動物源性成分日常鑒定和風險評估具有重要的應用價值。

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