中空纖維離心超濾法測定乳制品中5種添加劑

劉彥，張巖，付海麗，劉睿思，蔣曄

（河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊050017）

山梨酸、苯甲酸和脫氫乙酸均具有抑菌或抗菌作用，常作為防腐劑用于食品工業(yè)生產(chǎn)中；安賽蜜和糖精鈉為常用的食品矯味劑，一般在食品加工中用來改善口味。上述5種食品添加劑均廣泛應(yīng)用于各類食品中，但過量攝入會(huì)對人體造成危害，特別是肝、腎器官，甚至引發(fā)癌癥[1]。因此，在國家頒布的GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]中對乳制品中食品添加的類別和限量做了明確規(guī)定，安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的限用量分別為0.3、1.0、0.5、0.3 g/kg，含乳飲料中糖精鈉的限用量為0.15 g/kg。

目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道食品中防腐劑和矯味劑的含量測定方法，常見的有高效液相法（chromatography high performance liquid，HPLC）[3-7]、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[8]、氣相色譜法 （gas chromatography，GC）[9]、離子色譜法[10]、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[11]等。由于乳制品基質(zhì)較為復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等可影響色譜分析準(zhǔn)確度的大分子物質(zhì)，因此，該類樣品分析檢測前需進(jìn)行樣品前處理。文獻(xiàn)中去除蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)常采用沉淀蛋白法[12-15]，或聯(lián)合液液萃取[16]、固相萃取[17]等方法對樣品進(jìn)一步純化，操作過程繁瑣、耗時(shí)，且易造成偶然誤差降低結(jié)果準(zhǔn)確度。因此，本文采用新型的中空纖維離心超濾裝置，無需沉淀蛋白，一步即可完成分離、純化過程，且首次用于同時(shí)測定乳制品中的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和脫氫乙酸的含量，其結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

U3000高效液相色譜儀：戴安（美國）；聚砜中空纖維、聚丙烯中空纖維（膜厚 200 μm，內(nèi)徑 1 mm）：杭州凱潔膜分離技術(shù)有限公司；苯甲酸對照品（批號：100419-201302）：中國藥品生物制品檢定所；山梨酸對照品（批號：40124）：德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH；糖精鈉對照品（批號：40904）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；安賽蜜（批號：60263-06-1）：中檢所；脫氫乙酸（批號：YSJ-04260G）：上海遠(yuǎn)慕；早餐奶（批號：2P20170616 BU03）：內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；酸奶（批號：20170712.05）：北京三元食品股份有限公司；養(yǎng)樂多（批號：20170708）：養(yǎng)樂多（中國）投資有限公司；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

采用DiamonsilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.02mol/mL乙酸銨溶液（4∶96，體積比），流速為1.0mL/min，檢測波長分別為230 nm（安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸）、254nm（糖精鈉），進(jìn)樣量5μL。

1.3 溶液配制

對照品溶液：精密稱取安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸對照品分別為 10.00、10.02、10.01、10.00、9.98 mg，置10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，分別得對照品貯備液濃度為1.000、1.002、1.001、1.000、0.998 mg/mL。

供試品溶液：精密稱取待測樣品溶液1.0 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得樣品溶液。

1.4 中空纖維離心超濾法

將中空纖維切成15 cm的小段，放入甲醇-水（50∶50，體積比）混合溶液中超聲清洗30 min，晾干備用。吸取0.5 mL樣品溶液注入自制玻璃管（長度：7.5 cm，內(nèi)徑：3 mm），將洗好備用的中空纖維置于玻璃管中（裝置圖見圖1），以4 000 r/min離心15 min，然后取出中空纖維，收集中空纖維內(nèi)的液體，即得供試品溶液。

圖1 離心超濾裝置圖Fig.1 Diagram of hollow fiber ultrafiltration

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理方法的選擇

乳制品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)，可影響色譜分析，因此，檢測前均需進(jìn)行樣品前處理。傳統(tǒng)的乳制品樣品前處理方法均為沉淀蛋白法，或聯(lián)合液相萃取、固相萃取等方法，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，且易造成損失導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。而中空纖維離心超濾技術(shù)主要應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中小分子物質(zhì)的分離、純化，如成分復(fù)雜的制劑中小分子物質(zhì)的檢測[18]、藥物小分子與高分子聚合物的分離[19-20]或游離藥物的測定[21]等。該方法僅通過離心操作即可去除蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，濾液可直接進(jìn)樣，裝置簡單，操作快捷；且在該方法中離心力的方向與中空纖維的軸向方向始終處于平行的狀態(tài)，有利于克服濃差極化現(xiàn)象，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。因此，本文采用中空纖維離心超濾法用于乳制品中防腐劑和矯味劑的分析測定。

2.1.2 非特異性吸附的考察

非特異性吸附是中空纖維膜分離過程中的常見現(xiàn)象，因此，本試驗(yàn)分別考察了聚砜、聚丙烯兩種膜材對苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、脫氫乙酸和糖精鈉的吸附性。取濃度為10 μg/mL的混合對照溶液，按1.4項(xiàng)下進(jìn)行離心超濾，進(jìn)樣分析并計(jì)算回收率。結(jié)果表明：膜材為聚砜的中空纖維對脫氫乙酸和安賽蜜有明顯的吸附作用，回收率＜70.0%；而膜材為聚丙烯的中空纖維對5種待測物質(zhì)幾乎不吸附，回收率＞93.5%，故選擇聚丙烯中空纖維作為膜材料。

2.1.3 離心轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

采用樣品前處理方法是離心超濾法，濾過速度和濾過液的量主要取決于離心力。文中考察了離心時(shí)間為 15 min 時(shí)，離心轉(zhuǎn)速分別為 2 000、4 000、6 000、8 000 r/min濾過液的量，結(jié)果表明，當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min時(shí)濾過液體積基本趨于穩(wěn)定，因此，選擇離心條件為 4 000 r/min，15 min。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在1.2項(xiàng)色譜條件下，分別取5種混合對照品溶液（濃度約為20 μg/mL）及早餐奶加樣樣品溶液（5.05 μg/mL）進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖2），由圖可見，5種待測物質(zhì)在上述色譜條件下完全分離，峰形良好，且供試品溶液未有干擾。

圖2 混合對照品溶液、早餐奶加樣樣品溶液色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substance solution and sample solution

2.3 線性、檢測限和定量限

分別精密量取安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉對照品貯備液各1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，得各組分濃度約為100 μg/mL混合對照溶液，依次稀釋得各組分濃度分別為0.50、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的混合對照溶液，按 1.2 項(xiàng)下色譜條件測定，以各組分峰面積對其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

取對照品溶液，逐級稀釋各對照品進(jìn)樣，當(dāng)峰高為基線噪音的3倍和10倍量時(shí)，測得5種待測物質(zhì)的檢測限及定量限，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 The equations of linear regression and correlation coefficients

2.4 精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn)

取濃度為10.0 μg/mL的混合對照品溶液，按1.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各待測物質(zhì)峰面積，計(jì)算得安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉峰面積的RSD分別為0.8%、0.3%、0.2%、0.2%、0.2%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

取早餐奶一份，5種待測物質(zhì)加樣濃度為10.0 μg/mL，按1.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得5種待測物質(zhì)峰面積的RSD均小于1.0%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

取同一早餐奶樣品5份，5種待測物質(zhì)加樣濃度為10.0 μg/mL，按1.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算得5種待測物質(zhì)峰面積的RSD均小于1.3%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

精密量取早餐奶、酸奶、養(yǎng)樂多各9份，每份1.0mL，置5 mL量瓶中，每種樣品3份為一組共3組，3組樣品分別加入各待測物質(zhì)的對照品儲(chǔ)備液25、50、100 μL，加水定容，得加樣濃度分別為5.00、10.0、20.0 μg/mL的樣品溶液。按照1.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，記錄峰面積，得回收率結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 2 Results of the recovery tests（n=3）

2.6 樣品測定

取早餐奶、酸奶、養(yǎng)樂多3種樣品，按照1.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別對早餐奶、酸奶、養(yǎng)樂多中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸含量進(jìn)行分析測定（色譜圖見圖3），每種樣品平行制備3份，取含量平均值，結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，僅在養(yǎng)樂多樣品中檢測到苯甲酸，含量未超標(biāo)，符合GB 2760-2014要求范圍。

圖3 早餐奶樣品、酸奶樣品、養(yǎng)樂多樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of breakfast milk sample solution，youhurt sample solution and YangLeDuo sample solution

表3 樣品含量測定結(jié)果Table 3 The determination results of sample content

3 結(jié)論

建立中空纖維離心超濾法用于分析乳制品中5種食品添加劑的含量，該方法經(jīng)一步樣品前處理方法即可除去乳制品中大分子物質(zhì)，省時(shí)省力，且準(zhǔn)確度高，回收率均大于93.5%，RSD<1.4%，為乳制品中食品添加劑的含量分析提供了簡便、快捷、可靠的檢測手段。

[1]石立三,吳清平,吳慧清,等.我國食品防腐劑應(yīng)用狀況及未來發(fā)展趨勢[J].食品研究與開發(fā),2008,29(3):157-161

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014

[3]孫稚菁,任國杰,王靈芝,等.果脯蜜餞和果凍中10種食品添加劑的同時(shí)測定[J].食品研究與開發(fā),2017,38(7):133-137

[4]羅亮,姚幫本,吳巧.高效液相色譜法測定食品中5種防腐劑和甜味劑[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(10):95-97

[5]盛琦,劉素娟,馮峰,等.高效液相色譜法同時(shí)測定8種食品添加劑[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,55(21):5620-5622

[6]高文惠,龐軍,高林,等.高效液相色譜法同時(shí)測定食品中多種添加劑[J].中國食品學(xué)報(bào),2014,14(12):148-153

[7]林海丹,鄒志飛,秦燕,等.高效液相色譜法同時(shí)測定食品中18種食品添加劑[J].食品科學(xué),2013,34(8):228-231

[8]郭芳芳,馮鋒,白云峰,等.高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測法同時(shí)檢測雪糕中多種添加劑[J].食品科學(xué),2015,36(8):206-210

[9]周家萍,李典,李治東,等.氣相色譜法同時(shí)測定食品中8種防腐劑[J].食品研究與開發(fā),2017,38(14):161-163

[10]朱懷遠(yuǎn),莊亞東,熊曉敏,等.離子色譜法直接測定食品添加劑中的甜蜜素[J].食品科學(xué),2012,33(2):173-176

[11]曹婭,孫利,凌云,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定食用植物油和調(diào)味油中27種添加劑(物)[J].食品科學(xué),2013,34(4):129-134

[12]袁鳳琴,王佳,牛愛華,等.高效液相色譜法同時(shí)檢測酸性乳飲料及冰淇淋中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào),2014,5(5):1434-1438

[13]李素琴,趙貞,劉麗君,等.高效液相色譜法檢測乳制品中7種添加劑[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2016,39(4):22-25

[14]霍艷敏,段文增,王駿,等.高效液相色譜法同時(shí)測定乳制品中7種防腐劑[J],理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊,2013,49(5):580-583

[15]趙貞,萬鵬,李翠枝,等.HPLC法檢測乳制品中2種甜味劑和3種防腐劑[J].中國乳品工業(yè),2014,42(2):58-59,64

[16]張敬波,姜俊,佟克興,等.氣相色譜法測定乳制品中的脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯[J].中國乳品工業(yè),2013,41(4):45-47

[17]楊紅梅,王浩,郭啟雷,等.固相萃取-高效液相色譜法測定牛奶及蛋白類飲料中10種防腐劑[J].食品研究與開發(fā),2011,32(5):123-126

[18]安靜,董占軍,孫源.HPLC法測定茵梔黃口服液中的黃芩苷[J].華西藥學(xué)雜志,2015,30(2):236-237

[19]豆妮娜,冉叢聰,杜朝暉,等.中空纖維離心超濾-HPLC法測定酮洛芬凝膠劑[J].中國醫(yī)藥工業(yè),2016,47(1):71-73

[20]許萌,陳丹,蔣曄.中空纖維離心超濾-HPLC法測定注射用兩性霉素B脂質(zhì)體的包封率[J].沈陽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,31(9):692-696

[21]Junmei Li,Qingwen Shi,Ye Jiang,et al.Pretreatment of plasma samples by a novel hollow fiber centrifugal ultrafiltration technique for the determination of plasma protein binding of three coumarins using acetone as protein binding releasing agent[J].Journal of Chromatography B,2015,1001:114-123