高效液相色譜法同時測定方便面中16種多環芳烴

高慧，汪洋，王敏，王勤

（淄博市疾病預防控制中心，山東淄博255026）

多環芳烴是（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）指兩個或兩個以上苯環[1]以稠環形式相連的化合物有4個或少于4個苯環的屬于輕質多環芳烴，多于4個苯環的屬于重質多環芳烴[2]。在目前環境中存在廣泛，食物在高溫時會分解出大量的多環芳烴，多環芳烴可通過皮膚、呼吸道和被污染的食物進入人體，在體內代謝活化為多環芳烴環氧化物，與DNA、RNA和蛋白質等生物大分子結合而誘發突變和腫瘤[3]，其暴露的最大毒性為致癌性[4]。植物油中多環芳烴的檢測方法有色譜-質譜法[5]、高效液相色譜法[6-8]、超高效液相色譜法[9-10]。目前方便面中多環芳烴的檢測方法，報道較少。由于方便面樣品基質復雜，因此建立一種靈敏，高效的檢測方法是發展的必然趨勢。本研究通過對色譜條件、樣品前處理條件等的優化，建立了一種快速、準確測定方便面中16種多環芳烴的高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀（帶熒光檢測器和二極管陣列檢測器）：美國沃特世公司；12位固相萃取儀：美國色譜科公司；N-EVAP 112氮吹濃縮儀：美國OA-SYS；CP-225D電子天平：德國賽多利斯；ST-16R高速離心機：美國賽默飛世爾科技有限公司；KS-500D型超聲波清洗器：寧波科生儀器廠。

Milli-Q超純水系統：美國密理博公司；Oasis HLB固相萃取柱（6mL/200 mg）、Sep-Park Florsil固相萃取柱（6 mL/1 g）：美國沃特世公司；石油醚、乙腈、丙酮、二氯甲烷、甲醇、正己烷、甲苯（均為HPLC級）：德國默克公司；16種PAHs標準溶液（200 μg/mL，甲醇溶劑），編號：Z-013-17：美國AccuStandard公司。精確取16種PAHs有證標準溶液（200 μg/mL）50 μL，加 2 mL 甲苯，用乙腈定容至10 mL，制得標準溶液中間液（1 000 ng/mL）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱（WatersPAHC18analytical column，4.6mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：水+乙腈；流速：1.0 mL/min。流動相梯度見表1。

表1 流動相梯度表Table 1 Mobile phase gradient table

苊烯在熒光沒有響應，所以用二極管陣列檢測器檢測，其他15種PAHs用熒光檢測器檢測。兩個檢測器流動相梯度相同，檢測波長苊烯：230 nm，其他15種PAHs的檢測激發波長和發射波長見表2。

表2 15種PAHs的檢測激發波長和發射波長Table 2 Detection excitation wavelength and emission wavelength of 15 PAHs

續表2 15種PAHs的檢測激發波長和發射波長Continue table 2 Detection excitation wavelength and emission wavelength of 15 PAHs

1.2.2 樣品前處理

稱取方便面樣品20.0 g，以石油醚進行油脂提取，提取液加熱揮發除去石油醚，制備得到油脂，稱重，備用。稱取2.0 g油脂于15 mL塑料離心管中，加入5 mL乙腈：丙酮（1∶1，體積比）混合提取液，渦旋 30 s，超聲5 min，8 000 r/min下離心5 min。小心提取上層液體于另一10 mL離心管中，重復加提取液提取兩次，合并提取液，35℃水浴下氮吹至3.0 mL左右，等待過柱凈化。

第一次凈化：采用Waters Oasis HLB柱進行凈化，依次10 mL二氯甲烷、10 mL甲醇、10 mL乙腈對柱子進行活化；將上述提取液過柱，同時用玻璃離心管進行收集；再用5 mL乙腈 ∶丙酮（1∶1，體積比）進行清洗，5 mL二氯甲烷進行洗脫兩次，洗脫液均收集于玻璃離心管中，收集的洗脫液于35℃水浴下氮吹至0.2 mL左右，加入正己烷定容至2.0 mL（等待后續第二次凈化用）。

第二次凈化：采用Sep-Pak Florsil柱進行凈化，依次15 mL二氯甲烷、15 mL正己烷對柱子進行活化；將第一次凈化后收集液過柱，同時用玻璃離心管進行收集；再分別用5 mL正己烷清洗，5 mL正己烷∶二氯甲烷（2∶1，體積比）洗脫兩次，洗脫液收集于同一玻璃離心管。

濃縮：將第二次凈化后的洗脫液在35℃下氮吹濃縮至近干，加入甲苯0.2 mL，加入乙腈定容至1.0 mL，過0.22 μm的有機過濾膜后供HPLC上機測定。

1.2.3 標準曲線繪制

用1.1標準溶液中間液（1 000 ng/mL）稀釋出1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL 標準系列溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，根據標準溶液的濃度和峰面積進行回歸，繪制標準曲線，以保留時間定性。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇和優化

2.1.1 檢測器的選擇

檢測的16種PAHs在紫外區都有吸收，二極管陣列檢測器能同時測定，但靈敏度比較低，對16種PAHs的檢出限約為1 μg/mL；而選擇用熒光檢測器靈敏度更高，除苊烯在熒光沒有響應，其余15種PAHs檢出限可達到0.7 ng/mL；所以選擇了苊烯用二極管陣列檢測器進行檢測，其余15種PAHs用熒光檢測器進行檢測。

2.1.2 色譜柱的選擇

選用了PAHs的專用色譜柱Waters PAH C18，分離度明顯優于普通C18色譜柱，且只需采用乙腈-水的梯度洗脫即可實現完全分離。配制濃度為50ng/mL的15種PAHs的分離色譜圖見圖1。

圖1 15種PAHs標準色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of 15 PAHs

按照上述前處理方法提取后的方便面樣品圖譜見圖2，除苯并（g，h，i）芘未檢出外，其它 14 種 PAHs均有不同濃度的檢出。

圖2 樣品的液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of the sample

2.1.3 流動相的選擇

因15種PAHs中有許多是同分異構體，要使這些同分異構體在適宜的時間內有效分離并峰形良好，采用了不同比例的乙腈和水進行梯度洗脫，結果表明：乙腈比例高時，目標峰保留時間短，出峰快，峰行尖銳，但苊和芴分離不到基線；乙腈比例低時，分離效果好，但峰形拖尾嚴重；根據流動相對不同PAHs的洗脫能力以及色譜柱和梯度泵的最大承受壓力，反復調整，最后選擇了最優化的梯度洗脫程序（表1）。苊烯用該梯度洗脫程序也分離良好。

2.1.4 檢測波長的選擇

熒光檢測器中化合物的激發波長和發射波長決定了該化合物的檢出限和靈敏度，故根據15種PAHs在不同波長下的響應值及出峰時間，選擇了最佳的檢測波長程序。在該最佳波長程序下進行檢測，15種PAHs的靈敏度高，檢出限低，完全可以滿足方便面中PAHs的檢測。苊烯在紫外230 nm下相應最高，因此選擇了230 nm進行測定。

2.2 固相萃取條件優化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

影響方便面中PAHs測定的主要因素是方便面中的極性脂類和脂肪等，GB5009.265-2016[11]《食品安全國家標準食品中多環芳烴的測定》選用溶劑提取的方法，回收率和精密度均不理想。本方法選用了水可浸潤的反相吸附柱Oasis HLB，該柱由親水性的N-乙烯吡咯烷酮和親脂性的二乙烯基苯按特定比例聚合而成。它以特別的“極性鉤”為增強極性物的保留提供了優異的反相保留容量，也由于這個“極性鉤”的存在而能保持很好的潤濕性，避免了意外干涸導致的回收率不高問題。與傳統的C18小柱相比，Oasis HLB具有更高的吸附容量，更高的保留能力，更寬的pH值適用范圍，更高的穩定性，提高了樣品的回收率和精密度。

由于方便面基質復雜，又選用了Sep-Pak Florsil正向吸附柱進行二次凈化，Sep-Pak Florsil的吸附劑是弗羅里硅土，是一種極性、高活性、弱堿性吸附劑，可以從非水相樣品溶液中吸附中等極性分析物，因此既可吸附多余的脂肪和色素等雜質[12]，也可完全吸附待測物，再分別用不同極性溶劑進行洗脫，達到凈化待測物的目的。

2.2.2 萃取條件優化

反相吸附柱Oasis HLB富集PAHs后，需要一種極性合適的溶劑能夠清洗雜質并保留待測物，再選擇一種溶劑洗脫待測物，乙腈能夠清洗雜質但洗脫不完全，丙酮的溶解性太強能夠完全清洗雜質但會使少許待測物進入液相，二氯甲烷能夠對待測物有最大溶解度。因此選擇先用乙腈∶丙酮（1∶1）進行清洗，能夠保持待測物的最大保留，再選用二氯甲烷洗脫，保證了雜質的最大清洗和待測物的最大洗脫。

正向吸附柱Sep-Pak Florsil進行凈化時，需要一種極性較弱的有機溶劑才能保證待測物的最大保留和雜質的最大洗脫，再用極性較強溶液洗脫待測物進行檢測。因此選用了正己烷清洗殘留的雜質，正己烷∶二氯甲烷（2∶1）洗脫待測物。

2.3 線性范圍及檢出限

在本試驗條件下，按照1.2.1色譜條件進行測定，以峰面積對相應的多環芳烴化合物質量濃度作圖，所得的16種PAHs的線性方程，根據3倍信噪比的計算方法求得方法的最低檢出限，10倍信噪比的濃度為最低定量濃度。以取樣20 g樣品可制備4.0 g油脂，取2.0 g油脂進行凈化、濃縮最后定容至1.0 mL計，分別得到最低檢出限和最低定量限見表3。

表3 16種PAHs的高效液相色譜測定法的線性范圍、檢出限和定量限Table 3 The linear range，detection limit and quantitative limit of 16 PAHs for HPLC

2.4 加標回收率和精密度

稱取20.0 g未檢出PAHs的方便面樣品于聚四氟乙烯離心管中，分別添加質量濃度為1.0、5.0、10.0 ng/mL的標準溶液，每個水平6份，充分混勻，放置2 h后按照最佳前處理和色譜分析條件進行測定，回收率在75.8%～95.3%之間，RSD為2.87%～5.23%，結果見表4。

表4 16種PAHs的加標回收率和相對標準偏差Table 4 The recoveries and relative standard deviations of 16 PAHs

2.5 樣品測定

淄博市2016年共監測隨機采集的山東省在售170份方便面樣品，本次檢測樣品覆蓋所有市場銷售的方便面品牌。其中苯并（a）芘檢出17份，檢出率10.0%，合格率100.0%；萘、菲檢出率最高達到98.8%，只有2份未檢出；蒽、熒蒽檢出率也較高在90.0%以上；苯并（g，h，i）芘、苊烯均未檢出，檢出率為 0。油炸型方便面的輕質PAHs和重質PAHs污染程度均高于非油炸型方便面；油炸型方便面的萘污染程度最高，高達65.9 μg/kg；非油炸型方便面的熒蒽污染程度最高，達到 37.5 μg/kg。

3 結論

通過對方便面樣品固相微萃取條件和色譜條件的優化，選擇了最佳檢測條件，實現了對方便面中16種PAHs的同時測定，達到了很好的分離效果。該方法具有操作簡便、靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬、雜質干擾少及結果準確可靠等優點。因方便面中干擾物復雜，選用Oasis HLB和Sep-Pak Florsil兩種固相萃取柱凈化，既能實現方便面中復雜干擾物的去除又能實現待測物的完全保留和洗脫，實現了HPLC對16種PAHs的完全分離檢測，滿足了方便面中PAHs的分析測試要求。

[1]何燕,王淑惠,解彥平,等.高效液相色譜法測定空氣中的16種多環芳烴[J].現代預防醫學,2015,42(8):1475-1478,1500

[2]董峰光,王朝霞,宮春波.食用植物油中多環芳烴的來源和處理[J].現代預防醫學,2014,41(11):1993-1995,1998

[3]孫長顥.營養與食品衛生學[M].6版.北京:人民衛生出版社,2007:312-313

[4]賈鴻寧,戴紅.多環芳烴的致癌性及其機制研究進展[J].大連醫科大學學報,2009,31(5):604-607

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T23213-2008植物油中多環芳烴的測定氣相色譜-質譜法[S].北京:中國標準出版社,2008

[6]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T24893-2010/ISO 15753:2006動植物油脂多環芳烴的測定[S].北京:中國標準出版社,2006

[7]喬海鷗,王敏娟,胡佳薇,等.高效液相色譜法同時測定植物油中的15種多環芳烴[J].中國食品衛生雜志,2013,25(5):434-437

[8]曹小麗,楊曉倩,劉素華.熒光檢測法測定植物油中15種多環芳烴[J].中國衛生檢驗雜志,2013,23(12):2580-2629

[9]倪進治,王軍,李小燕,等.超高效液相色譜熒光檢測器測定土壤中多環芳烴[J].分析試驗室,2010,29(5):25-28

[10]那廣水,劉春陽,張琳,等.固相膜萃取-超高效液相色譜-熒光法測定基地水體中多環芳烴[J].分析試驗室,2011,30(1):29-31

[11]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會,國家食品藥品監督管理總局.GB5009.265-2016食品安全國家標準食品中多環芳烴的測定[S].北京:中國標準出版社,2016

[12]董桂賢,王朝霞,周曉歌,等.超高效液相色譜法同時測定植物油中15種多環芳烴[J].衛生研究,2014,43(4):620-623