高效液相色譜串聯質譜法測定豆芽中4種藥物殘留

2018-05-30 09:34:54

食品研究與開發 2018年10期

（寧夏回族自治區食品檢測中心，寧夏銀川750001）

豆芽是深受廣大消費者歡迎的食品，具有較高的營養價值。近年來，市場上曝光市場豆芽存在質量安全隱患[1-3]，同時在執法檢查中發現部分豆芽生產者為縮短生產周期、增加產量、改善豆芽外觀，在生產黃豆芽、綠豆芽、豆苗的過程中非法添加“AB粉”、“無根豆芽素”等化學物質的現象，濫用的植物生長調節劑會給健康帶來風險，已成為目前食品安全領域的一個重大問題[4]。國家食品藥品監督管理總局、農業部、國家衛生和計劃生育委員會2015年11號公告明確規定在豆芽生產過程中不得使用4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素等物質。

目前，國內外有關4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素等物質檢測方法主要以氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]和色譜－質譜聯用法[7-9]為主。不同的檢測方法具有其特定的優缺點：運用氣相色譜法（gas chromatography，GC）和氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）時通常要進行衍生化的復雜操作，且存在定性不足和靈敏度低等問題；液相色譜法不需要衍生處理，但同樣存在選擇性差、靈敏度低、易受復雜樣品基質干擾且難以實現確證分析等問題。高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）具有高特異性和高靈敏度，是目前廣泛應用的檢測方法。本試驗通過優化質譜參數和色譜條件，考察流動相、提取方法和基質效應等因素，建立HPLC-MS/MS法結合分散萃取技術同時測定豆芽中4種藥物殘留，該方法準確可靠，回收率穩定，能滿足日常豆芽藥物殘留的檢測要求。為嚴厲打擊豆芽違法添加禁限用物質的行為，實現對豆芽生產及市場的有效監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆芽：市售。

赤霉素（gibberellic acid，GA3）、6-芐基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-AB）、4-氯苯氧乙酸（4-chlorophenoxyacetic acid，4-CPA）、2，4- 滴（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）：德國 Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于98%；甲醇、乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；C18、硫酸鎂：適用于QuEChERS方法的填料，美國安捷倫公司；甲酸（色譜純）、乙酸銨（優級純）、冰乙酸（優級純）：德國SIGMA公司；氯化鈉（優級純）：國藥集團化學試劑有限公司；所有用水均為超純水。

Aglient6460三重四級桿質譜：配Aglient 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；IKA T25數顯型分散機：德國IKA公司；BUCHI V-850旋轉蒸發儀：瑞士步琦實驗室公司；BS224電子天平：賽多利斯科學儀器公司；HGC-24方形干式加熱氮吹儀：北京恒奧德儀器儀表有限公司；3-15高速離心機：德國Sigma公司。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取適量赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴標準品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的標準儲備液；分別移取標準儲備溶液適量用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合標準中間溶液；準確移取混合標準中間溶液適量用空白基質提取液稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L 系列標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 試樣制備

取200 g左右樣品加入等質量的去離子水，經均質機均質并混合均勻后，應立即測定。

1.3.2 試樣溶液的制備

稱取混合均勻的豆芽樣品10 g（精確至0.01 g）于100 mL離心管中，加入15 mL 5%乙酸乙腈，渦旋混勻，10 000 r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿1 min。在4℃條件下8 000 r/min冷凍離心5 min，上清液備用。

1.3.3 凈化

準確稱取0.15 gC18和0.90 g硫酸鎂于15 mL離心管中，渦旋混勻。加入5.0 mL上清液，渦旋1 min，去除雜質，在4℃條件下8 000 r/min冷凍離心5 min。取出后放置室溫，再取上清液1.0 mL于50℃下氮吹至干，準確加入1.0 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜-串聯質譜儀分析測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1（內徑）mm 100 mm，粒徑 3.5 μm；進樣量：10 μL；柱溫：30.0 ℃；流速：0.30 mL/min；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨-0.05%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase composition for linear gradient elution

1.4.2 質譜條件

離子源：AJS ESI源；掃描方式；負模式；檢測方式：多反應監測（multiple reactions monitoring，MRM）；霧化氣壓力：3.1 bar；噴嘴電壓：500 V；干燥氣溫度與流速：325℃，7 L/min；鞘氣溫度與流速：375℃，11 L/min；毛細管電壓：3 000 V。豆芽中4種藥物殘留的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數見表2。

表2 豆芽中4種添加物的質譜分析參數Table 2 MS/MS parameters for four additives in bean sprouts

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

由于4-氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和赤霉素的分子結構中均含有羧基；6－芐氨基嘌呤可產生[M+H]＋離子，也可以形成穩定的[M+H]－離子。因此采用負離子方式對4種添加物進行電離。分別對濃度為1.0 μg/mL的目標化合物進行單針進樣，優化其質譜條件。當目標化合物進入一級質譜后，可產生穩定的[M+H]離子[10]。確定母離子后，在SIM模式下優化各目標化合物的碎裂電壓。母離子進入二級質譜，產生不同的離子碎片。在子離子掃描模式下，優化碰撞能量，得到相應的離子碎片。4種添加物的二級離子質譜圖見圖1，MRM色譜圖見圖2。

圖1 豆芽中4種添加物的二級離子質譜圖Fig.1 MS/MS spectra for four additives in bean sprouts

圖2 豆芽中4種添加物的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms for four additives in bean sprouts

2.2 色譜條件優化

赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴在不同的流動相中分離程度不同，對比3種流動相甲酸水溶液、乙酸銨水溶液、乙酸銨-甲酸水溶液。通過試驗，各待測物在乙酸銨-甲酸水溶液流動相中的分離程度及峰形較好。因此選擇5 mmol/L乙酸銨-0.05%甲酸水溶液和乙腈為流動相；在ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱通過梯度洗脫對4種添加物進行分離，目標化合物的保留時間為2 min～7 min之間。

2.3 樣品前處理條件的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇

對比乙腈、含2%乙酸乙腈、含5%乙酸乙腈3種溶液作為提取溶劑時，各待測物的回收率。其中含5%乙酸乙腈溶液做為提取溶劑時，回收率最高。

2.3.2 凈化條件的優化

分別在 MgSO4+C18、C18+PSA、MgSO4+C18+Carbon 3種凈化條件下進行試驗，不同凈化材料可以選擇性地保留基質干擾成分，達到凈化效果。但使用PSA和Carbon時對目標物也有一定的吸附，回收率偏低。最終采用MgSO4+C18作為凈化劑時，各待測物的回收率較高。

2.4 基質效應

基質效應是在提取基質中的目標物時，基質中的干擾物影響目標化合物的離子化，使得目標化合物在儀器上的響應發生了增強或者抑制的現象[11]，影響分析結果的準確性。考察4種化合物在豆芽中均為基質抑制效應.為提高目標化合物測定的準確度，本方法使用空白基質提取液配制標準曲線，降低基質干擾的影響。

2.5 方法的線性范圍和檢出限

將 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L 系列基質標準工作溶液分別進行測定。以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴在1.0 μg/L～200.0 μg/L的范圍內，其濃度與各待測物的峰面積呈良好的線性關系。4種添加物的線性回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限（信噪比S/N≥3）見表3。

表3 豆芽中4種添加物的線性回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限Table 3 Linear equation，coefficient correlation，linear range，LODs of four additives in bean sprouts

2.6 方法的準確度和精密度

由寧夏食品檢測中心自制3種不含目標化合物的豆芽（黃豆芽、綠豆芽、扁豆芽）作為空白樣品進行加標回收率試驗，添加水平分別為0.045、0.090、0.15 mg/kg進行測定，其中赤霉素的回收率范圍為68.9%～115.2%；6-芐基腺嘌呤的回收率范圍為68.1%～105.8%；4-氯苯氧乙酸的回收率范圍為75.3%～119.0%、2，4-滴的回收率范圍為63.8%～102.6%。其相對標準偏差范圍為1.94%～12.34%，其精密度符合方法學的要求。赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴添加濃度及回收率的數據見表4。