益生菌對大鼠肝臟脂質過氧化損傷拮抗作用的研究

瞿恒賢，余洪波，黃瑩萍，席文博，黃玉軍，顧瑞霞，陳大衛，*

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225009；2.統一企業（中國）投資有限公司，江蘇昆山215300）

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝病，包括簡單脂肪變性，非酒精性脂肪肝炎，纖維化，肝硬化和肝細胞癌[1]。NAFLD的標志是脂質的細胞內積累，導致在肝細胞內形成脂滴。這種積累是由脂質合成和氧化之間的不平衡引起的[2-4]。與正常健康者相比，NAFLD患者呈現高水平的活性氧和脂質過氧化產物，而抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）和抗氧化劑谷胱甘肽（glutathione、GSH）等的表達降低[5]。目前，對非酒精性脂肪肝發病機制廣泛接受的理論是“二次打擊”學說[6]。第一次打擊主要是脂肪代謝失衡和胰島素抵抗導致脂肪在肝細胞中的沉積；第二次打擊即在第一次打擊的基礎上，出現氧化應激和脂質過氧化、線粒體功能失調，在細胞因子等共同作用下，引起脂肪性肝炎，進一步形成肝硬化，甚至肝癌[7-8]。脂質過氧化是NAFLD肝細胞損傷的主要原因[9-11]。活性氧通常由正常細胞的代謝產生，但肝臟脂質積累導致過氧化自由基不能狗夠被抗氧化防御抵消，從而誘發肝損傷[12]。

益生菌對NAFLD的作用越來越受到重視，大量研究表明，益生菌可以有效地預防和改善NAFLD。Ritze等[13]報道了鼠李糖乳桿菌對NAFLD的保護作用，在高糖飲食誘導的NAFLD模型小鼠中，有益細菌數量增加，腸屏障功能恢復，肝臟炎癥和脂肪變性也隨之減弱。Paik等[14]也發現，HFD喂養的大鼠在食用芽孢桿菌屬（Bacillus）6周后，血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和脂質過氧化水平均得以明顯改善。然而，盡管益生菌對NAFLD有明顯的有益作用，但其影響機制尚未完全明了。

脂質過氧化（lipid peroxidation）在NAFLD中扮演著重要角色[15]，有研究結果發現，益生菌通過拮抗脂質過氧化損傷，從而減輕肝臟炎癥[16-17]。本研究通過高脂飲食成功誘導SD雄性大鼠建立脂質過氧化損傷模型，應用單一及混合益生菌發酵乳進行干預，觀察益生菌對肝功能、肝內臟脂肪堆積以及脂質過氧化損傷狀態，評價益生菌對肝臟脂質過氧化損傷的拮抗效應，并探究其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 益生菌菌株

鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LV108、發酵乳桿菌（L.fermentum）grx08、干酪乳桿菌（L.casei）grx12：揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室保藏。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

5804R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；RM225組織切片機：德國萊卡公司；Axiocam erc5s型生物顯微鏡：德國Carl.Zeiss公司；7020型全自動生化分析儀：日本株式會社日立制作所。

1.2.2 主要試劑

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、TC、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、LDL-C、超氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）、SOD、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗動物與分組

5周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質量約150 g：揚州大學比較醫學中心。基礎飼料（面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮26%、豆料20%、魚粉2%、骨粉2%）適應性飼喂1周，適應有規律的12 h白天/12 h黑夜的循環，然后按各組間平均體重無顯著差異隨機分成4組，每組各10只，選取一組作為空白對照組，飼喂基礎飼料，其余3組通過飼喂4周高脂飼料（10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇和0.2%膽鹽和78.8%基礎飼料）建立高血脂大鼠模型。4周末，各組隨機選取一只處死進行肝臟HE染色，確定造模成功，造模成功后進行灌胃實驗，時間為4周。

動物分組與處理如下：空白組，日常飼喂普通飼料，灌胃給予生理鹽水（1 mL/100 g）；模型組，日常飼喂高脂飼料，灌胃給予生理鹽水（1 mL/100 g）；LV108組，日常飼喂高脂飼料，灌胃給予LV108發酵乳（1 mL/100 g，109CFU/mL）；混合發酵乳組，日常飼喂高脂飼料，灌胃給予簡單混合發酵（1 mL/100 g，109CFU/mL），體積比LV108發酵乳 ∶grx08發酵乳 ∶grx12發酵乳=1∶1∶1。定時補充飲水和飼料，更換墊料。

1.4 標本的采集與處理

大鼠禁食12 h后，眼球取血，以12 000 r/min分離血清，-80℃儲存備用。取肝臟，稱重，取肝臟左葉，大小1 cm×1 cm×0.5 cm，4%多聚甲醛固定，存于4℃冰箱中備用；另取0.8 g組織塊，在預冷的生理鹽水中漂洗，沖去表面血液，然后濾紙拭干，稱重后放入燒杯中。加入預冷的pH值為7.4 Tris-HCl（體積比1∶9的勻漿液），迅速用手術剪刀剪成碎塊。組織勻漿器進行勻漿操作，然后在 4℃條件下離心（4 000×g，15 min），吸取上清液，存于-80℃冰箱中備用。

1.5 大鼠體重及飲食量

每周測定一次大鼠的體重，每天記錄每組大鼠飲食量。大鼠處死前測定空腹體重。計算食物效應比（攝入每克食物造成的體重增加）。食物效應比計算公式如下：

1.6 大鼠肝臟病理觀察

經4%多聚甲醛固定，脫水，常規石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察組織病變情況。

1.7 指標檢測

血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）均由 7020型全自動生化分析儀一同測定；肝臟超氧陰離子自由基、羥基自由基、一氧化氮自由基（NO）、過氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化氫酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）均按照試劑盒提供的方法測定。

1.8 統計學方法

所有數據均采用SPSS進行統計分析，計量資料使用均數±標準差。

2 結果與分析

2.1 益生菌及其發酵乳對大鼠體重及飲食量的影響

益生菌對大鼠飲食量及體重的影響如圖1所示。

圖1 益生菌對大鼠飲食量及體重的影響（n=10）Fig.1 Effect of probiotics on food intake and body weight of rats（n=10）

由圖1可以看出，大鼠對低脂飼料的攝入要高于高脂飼料，這是因為低脂飼料的能量密度比較低。益生菌發酵乳LV108組和混合組消耗的飼料與模型組消耗的飼料無顯著性差異，表明益生菌的干預并沒有影響食物的攝入。第4周益生菌干預后，益生菌LV108組和混合組大鼠體重增加的速率較模型組相比明顯減緩，最終體重都顯著低于模型組（P＜0.05），說明益生菌干預能夠減緩大鼠體重的增加。如表1所示，兩組益生菌干預組的食物效應比也顯著低于模型組（P＜0.05）。

表1 益生菌對大鼠體重的影響（n=10）Table 1 Effects probiotics on weight parameters of rats（n=10）

2.2 益生菌及其發酵乳對大鼠血清指標的影響

益生菌對大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的影響如圖2所示。

圖2 益生菌對大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的影響（n=10）Fig.2 Effects of probiotics on serum TC、TG、HDL-C and LDL-C levels in rats（n=10）

由圖2結果顯示，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C與空白組相比均顯著增高（P＜0.05），分別增加了68.90%，21.61%，82.14%；HDL-C含量明顯降低（P＜0.05），較空白組降低了27.08%，說明高脂飲食模型造成了大鼠脂質代謝平衡被破壞，產生過多的脂肪酸，從而使血清中的TG、TC水平升高，肝臟脂肪酶加速清除HDL，使HDL-C含量降低，LDL-C含量升高。益生菌干預后，與模型組相比，LV108組與混合組大鼠血清的 TG、TC、LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）；HDLC顯著升高（P＜0.05）。其中，TG降低最明顯，LV108組和混合組分別降低了35.49%，36.59%。但與空白組比較，LV108組與混合組大鼠的TC、TG、LDL-C仍然有所升高，差異無統計學意義（P＞0.05），而HDL-C顯著降低（P＜0.05）。

2.3 益生菌及其發酵乳對大鼠肝臟病變情況的影響

大鼠肝臟HE染色觀察如圖3所示。

圖3 大鼠肝臟HE染色觀察（×200）Fig.3 H&E staining of mouse liver（×200）

由圖3可知，空白組大鼠肝臟肝小葉結構完整，細胞界限清晰，細胞核位于中央，未見脂肪空泡。模型組大鼠肝臟肝細胞結構被破壞，細胞腫脹，細胞間隙不清，脂肪沉積明顯，肝組織小泡性脂肪變性及水樣變性，可見大量肝細胞脂肪空泡。益生菌干預后，肝臟細胞的脂肪變性減輕，肝細胞脂肪空泡減少，且空泡更小。病理學研究的結果同血清反映的情況一致，說明益生菌干預能夠改善肝臟脂肪變性，對大鼠肝臟脂質過氧化損傷具有拮抗效應。

2.4 益生菌及其發酵乳對大鼠肝臟氧化指標的影響

益生菌對大鼠肝臟氧化指標的影響如表2所示。

由表2結果顯示，模型組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平與空白組相比顯著升高（P＜0.05），分別增加了 73.18%、24.35%、100%和37.93%；而SOD、GSH、GSH-Px、CAT水平顯著降低（P＜0.05），分別降低了 45.26%、31.67%、13.17%和39.85%。在益生菌干預以后，與模型組相比，LV108組和混合組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平均顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH、GSH-Px、CAT 水平顯著升高 （P＜0.05），其中LV108組對SOD、GSH和CAT的影響較大，較模型組分別增加了42.87%、32.93%和44.76%，而混合組對抗氧陰離子自由基、GSH和CAT的影響較大，較模型組抗氧陰離子自由基減少了30.36%，GSH和CAT分別增加了35.98%和53.68%。兩組益生菌組干預效果相當，無顯著性差異（P＞0.05）。但與空白組相比，LV108組和混合組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平仍然有所升高，SOD、GSH、GSH-Px、CAT水平有所降低，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 益生菌對大鼠肝臟氧化指標的影響（n=10）Table 2 Effects of probiotics on hepatic oxidants and antioxidants levels in rats（n=10）

3 討論

本研究旨在探究益生菌對大鼠肝臟脂質氧化損傷的拮抗效應機制。我們應用高脂飲食成功誘導大鼠建立脂質氧化損傷模型，結果也顯示了模型組大鼠與正常空白組大鼠相比出現了體重升高，血脂水平增高，光鏡下可見肝臟病理切片肝細胞結構被破壞，脂肪沉積明顯，可見大量肝細胞脂肪空泡。

益生菌干預有效的控制了血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。國內外的研究也發現益生菌可以降低血脂水平，并提高HDL-C水平[18-19]。同時，血脂水平在一定程度上能夠反映肝臟的損傷程度，間接說明了益生菌干預能夠拮抗肝臟脂質過氧化損傷。

此外，有研究報道了益生菌通過減少大鼠對高脂飲食中脂肪吸收來抑制血清TG和TC水平的增加[20-21]。益生菌對大鼠飲食量并沒有顯著影響，在相同的食物攝入量下，益生菌的干預顯著降低了高脂飼料的食物效應比，減少了高脂飲食中脂肪的吸收，從而減緩了大鼠體重的增加，降低了血清TG和TC的含量。

肝臟脂質代謝平衡被破壞，最為常見的是發生膽固醇代謝紊亂，其代謝的穩態依賴于膽固醇合成、吸收和排泄途徑。HDL能將外周細胞中游離膽固醇運到周圍的組織中去，實現膽固醇逆轉運，排除多余的膽固醇[22]。益生菌干預顯著提高血清中HDL-C水平，加速了膽固醇轉運和排泄，抑制了脂肪酸合成，也起到了降血脂的功效。

機體通過酶系統或非酶系統產生大量的自由基（如氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基等），自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物，消耗體內的抗氧化物質，并可引起生物膜損害、線粒體功能紊亂、ATP合成障礙等，導致細胞壞死和凋亡[23-25]。丙二醛（MDA）作為自由基作用于脂質產生過氧化反應的產物，其含量可反映機體內脂質過氧化程度，也是衡量機體自由基代謝的敏感指標，可間接反映肝臟細胞受自由基攻擊的嚴重程度[26]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸結合而成的小分子三肽化合物，是機體重要的抗氧化劑和自由基清除劑[27]。SOD、CAT和GSH-Px都是生物機體內重要的抗氧化酶，它們可以消除機體內的過氧化氫及脂質過氧化物[28]。SOD是機體清除超氧陰離子自由基最主要的酶。CAT主要存在于過氧化物酶體，清除機體過多的過氧化氫[29]。GSH-Px是一種以GSH為底物的重要抗氧化酶，通過保護機體免受H2O2造成的傷害，能降低脂質過氧化程度[30]。本實驗中模型組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平顯著升高，而 GSH、SOD、CAT、GSH-Px水平顯著降低，說明高脂飲食造成了肝細胞的脂質過氧化損傷。在在益生菌干預以后，大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平均有所降低，GSH、SOD、CAT、GSH-Px水平升高，說明益生菌可有效提高大鼠體內部分抗氧化酶活力和非酶抗氧化物質的含量，清除自由基、脂質過氧化產物，緩解肝臟受損的程度，有效對抗大鼠肝臟脂質過氧化損傷。

益生菌通過降低高脂飼料的食物效應比，緩解脂質堆積，調控血脂水平，維持大鼠體內部分抗氧化酶的活力和非酶抗氧化物質的水平，清除過氧化自由基，減少脂質過氧化產物的形成，拮抗肝臟脂質過氧化損傷，緩解肝臟受損的程度，減輕肝臟炎癥。但為進一步明確益生菌對大鼠肝臟脂質過氧化損傷拮抗機制，需后期從分子水平作深入研究。

[1]Henaomejia J,Elinav E,Jin C,et al.Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity[J].Nature,2012,482:179-185

[2]Donnelly K L,Smith C I,Schwarzenberg S J,et al.Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease[J].Journal of Clinical Investigation,2005,115(5):1343

[3]Malhi H,Gores G J.Molecular Mechanisms of Lipotoxicity in Nonalcoholic Fatty Liver Disease[J].Seminars in Liver Disease,2008,28(4):360-369

[4]Neuschwander-Tetri B A.Hepatic lipotoxicity and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis:the central role of nontriglyceride fatty acid metabolites[J].Hepatology,2010,52(2):774-788

[5]Qu L L,Yu B,Li Z,et al.Gastrodin Ameliorates Oxidative Stress and Proinflammatory Response in Nonalcoholic Fatty Liver Disease through the AMPK/Nrf2 Pathway[J].Phytotherapy Research Ptr,2016,30(3):402-411

[6]Day C P,James O F.Steatohepatitis:a tale of two “hits”?[J].Gastroenterology,1998,114(4):842

[7]Ascha M S,Hanouneh I A,Lopez R,et al.The incidence and risk factors of hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis[J].Hepatology,2010,51(6):1972-1978

[8]Tiniakos D G,Vos M B,Brunt E M.Nonalcoholic fatty liver disease:pathology and pathogenesis[J].Annual Review of Pathology,2010,5(5):145

[9]Roskams T,Yang S Q,Koteish A,et al.Oxidative stress and oval cell accumulation in mice and humans with alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease[J].American Journal of Pathology,2003,163(4):1301-1311

[10]Videla L A,Rodrigo R,Orellana M,et al.Oxidative stress-related parameters in the liver of non-alcoholic fatty liver disease patients[J].Clinical Science,2004,106(3):261

[11]Serviddio G,Bellanti F,Vendemiale G.Free radical biology for medicine:learning from nonalcoholic fatty liver disease[J].Free Radical Biology&Medicine,2013,65(6):952-968

[12]Muriel P.Role of free radicals in liver diseases[J].Hepatology International,2009,3(4):526-536

[13]Ritze Y,Bárdos G,Claus A,et al.Lactobacillus rhamnosus GG ProtectsagainstNon-AlcoholicFattyLiverDiseasein Mice[J].Plos One,2014,9(1):e80169

[14]Paik H D,Park J S,Park E.Effects of Bacillus polyfermenticus SCD on lipid and antioxidant metabolisms in rats fed a high-fat and high-cholesterol diet[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin,2005,28(7):1270

[15]Negre-Salvayre A,Auge N,Ayala V,et al.Pathological aspects of lipid peroxidation[J].Free Radical Research,2010,44(10):1125

[16]Gaudreau H.Tea extract render probiotic Lactobacillus helveticus more resistant to oxygen exposure through lipid modification mechanism[J].Food Research International,2016,81:141-148

[17]Chávez-Tapia N C,González-Rodríguez L,Jeong M S,et al.Current evidence on the use of probiotics in liver diseases[J].Journal of Functional Foods,2015,17:137-151

[18]Nido S A,Shituleni S A,Mengistu B M,et al.Effects of Selenium-Enriched Probiotics on Lipid Metabolism,Antioxidative Status,Histopathological Lesions,and Related Gene Expression in Mice Fed a High-Fat Diet[J].Biological Trace Element Research,2016,171(2):399-409

[19]Jackson K G,Lovegrove J A.Impact of probiotics,prebiotics and synbiotics on lipid metabolism in humans[J].Nutrition&Aging,2012,1(3/4):181-200

[20]Esposito E,Iacono A,Bianco G,et al.Probiotics reduce the inflammatory response induced by a high-fat diet in the liver of young rats[J].Journal of Nutrition,2009,139(5):905

[21]Kondo S,Xiao J Z,Satoh T,et al.Antiobesity Effects of Bifidobacterium breve Strain B-3 Supplementation in a Mouse Model with High-Fat Diet-Induced Obesity[J].Bioscience Biotechnology&Biochemistry,2010,74(8):1656-1661

[22]Hill S A,Mcqueen M J.Reverse cholesterol transport——a review of the process and its clinical implications[J].Clinical Biochemistry,1997,30(7):517

[23]Paradies G,Paradies V,Ruggiero F M,et al.Oxidative stress,cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(39):14205

[24]Rolo A P,Teodoro J S,Palmeira C M.Role of oxidative stress in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis[J].Free Radic Biol Med,2012,52(1):59-69

[25]Begriche K,Igoudjil A,Pessayre D,et al.Mitochondrial dysfunction in NASH:causes,consequences and possible means to prevent it[J].Mitochondrion,2006,6(1):1-28

[26]Gil L,Siems W,Mazurek B,et al.Age-associated analysis of oxidative stress parameters in human plasma and erythrocytes[J].Free Radic Res,2006,40(5):495-505

[27]Nordberg J,Arnér E S.Reactive oxygen species,antioxidants,and the mammalian thioredoxin system[J].Free Radical Biology&Medicine,2001,31(11):1287-1312

[28]Passardi F,Theiler G,Zamocky M,et al.PeroxiBase:the peroxidase database[J].Phytochemistry,2007,68(12):1605-1611

[29]Cederbaum A I,Lu Y,Wu D.Role of oxidative stress in alcohol-induced liver injury[J].Archives of Toxicology,2009,83(6):519

[30]Esposito L A,Kokoszka J E,Waymire K G,et al.Mitochondrial oxidative stress in mice lacking the glutathione peroxidase-1 gene[J].Free Radical Biology&Medicine,2000,28(5):754-766