以甾醇為底物微生物法合成甾體類化合物的研究進展

金俊，盧夢瑤，厲秋岳，吳正章，張鵬，馮文歡，常明，金青哲，*

（1.江南大學食品學院，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，國家功能食品工程技術研究中心，江蘇無錫214122；2.浙江省糧食科學研究所有限責任公司，浙江杭州310012；3.江蘇科鼐生物制品有限公司，江蘇泰興225400）

甾體化合物是一類重要的生命物質，被Witzmann博士譽為“生命的鑰匙”[1]。所有甾體化合物均由環戊烷多氫菲核（如圖1所示）為母核衍生而來，其中A、B、C為六元環，D為五元環，在C3、C11、C17位上可接羥基或酮基，在C10、C13位上可接角甲基，在C17位上可接烴基，在A或B環上可有部分雙鍵，這些官能團通過不同的組合進而衍生出各類甾體化合物[2]。甾體類化合物按用途主要分為甾體類藥物和甾體類功能食品兩大類：前者主要包括腎上腺皮質激素、性激素和蛋白同化激素等[3]；后者具有代表性的即為甾醇酯。

圖1 甾體化合物的母核分子結構圖Fig.1 The parent structure of steroids

傳統上，制備甾體類化合物多采用溶劑提取法或化學合成法。溶劑提取法存在著步驟多、得率低和溶劑毒性等缺陷，以從夏風信子中制備C-27甾體皂苷為例，需要至少7步提取，用到甲醇、氯仿、乙腈等有機溶劑，而得率不足0.05‰[1]。化學合成法彌補了溶劑提取法得率過低的問題，在20世紀中前半葉廣受關注，由我國著名化學家黃嗚龍研發的薯蕷皂素為原料制備可的松的工藝，在當時不僅填補了我國甾體類藥物生產的空白，且使我國在該領域一度處于世界領先地位。該法發展至今，我國甾體類藥物中間體的出口量可達1 000 t/年，全球市場達100億美元[4-5]。然而，化學合成法還是暴露出了步驟多、反應條件苛刻、污染嚴重、立體選擇性差等諸多缺點。因此，具有特異性、環保理念的微生物合成法制備甾體類化合物逐漸進入科學界視眼。

早期的微生物合成法多以植物皂素為原料、以細胞色素P450酶為催化劑，其中植物皂素多為薯蕷皂素、劍麻皂素和番麻皂素等[6]。但自20世紀70年代以來，植物皂素的提取遇到了瓶頸[7-9]：1）薯蕷皂素的重要來源黃姜，不能保證連續產出，資源日漸枯竭；2）提取植物皂素過程中使用的酶、酸和有機溶劑會使排放的廢水pH值、生物需氧量和化學需氧量等指標超標；3）提取殘渣目前無法二次利用，經填埋處理具有污染地下水的潛在危險性。這些因素促使國內外一些公司開始尋找和開發新的甾體類藥物原料。

隨著食用油脂工業的發展，毛油經堿煉脫酸、蒸汽脫臭等處理后會產生大量富含甾醇的副產物。甾醇中以植物甾醇最為人所知，它同樣以圖1的母核為基本結構，且資源豐富，被認為是工業化制備甾體類化合物的理想原料。以米糠油為例，其堿煉后的皂渣（提取谷維素后的皂腳）中植物甾醇含量可達15%～20%，其中β-谷甾醇占62%～72%，而其通過4步生物轉化即可制成強心苷元（一類用于治療心力衰竭的甾體類藥物）[1，10]。類似的研究發現，大豆油皂腳中含有毛油中約50%的植物甾醇，是制備五環三萜皂苷（可作為藥物或甜味劑）的重要來源[11-12]。除了常見的植物甾醇外，動物膽固醇、真菌甾醇（以麥角甾醇為主）同樣被視為珍貴的合成原料[1，13-14]。目前，研究工作主要集中在以甾醇為原料通過微生物法制備甾體類藥物（或其中間體）和甾醇酯，但因甾醇和微生物種類繁多，尋求合適的原料以高效合成相應的甾體類化合物成為實現工業化的前提。本文綜述了甾體類化合物的主要代表，分析了以甾醇為原料合成甾體類藥物和甾醇酯的典型路徑，以期為油脂加工副產物的高效利用提出新的途徑。

1 以甾醇為原料合成甾體類藥物

1.1 甾體類藥物的應用

目前，甾體類藥物多達400余種，為人熟知的有地塞米松、潑尼松、倍他米松、氫化可的松、黃體酮、睪丸酮及其衍生物等[15]，在治療皮炎、風濕關節炎、內分泌疾病和紅斑狼瘡等疾病方面有著舉足輕重的作用。

1.2 甾體類藥物微生物合成法的發展歷程

在全球范圍內，20世紀中后期處于甾體類藥物微生物合成法研發的熱潮之中。直至20世紀90年代，我國才認識到以甾醇為原料、以微生物為催化劑合成甾體類藥物的迫切性和必要性。中國科學院以此立項，當時浙江省糧食科學研究所作為參加單位配合研發該課題，以米糠油皂腳中提純的谷甾醇（純度＞90%）為原料進行微生物合成，但該課題未有圓滿結果，當時的研發成果成了現時一些小企業生產出口植物甾醇的技術資源。

21世紀初，俄羅斯、中國、泰國等國科學家相繼開發出利用分枝桿菌、海洋微生物等催化谷甾醇或混合植物甾醇合成甾體類藥物中間體（4-雄烯二酮：4-androstene-3，17-dione，4AD 和 1，4-雄二烯二酮：androsta-1，4-diene-3，17-dione，ADD）的技術，并具備產業化前景[16-18]。目前，該技術已在國內藥企投產，且部分企業正在開發以所制備中間體（4AD和ADD）為原料，進一步采用微生物合成甾體類藥物的技術，并逐步完成了多種孕激素和糖皮質激素類甾體藥物生產原料的切換[19]。

1.3 典型合成研究

以甾醇為原料（底物）、以微生物為催化劑合成甾體類藥物這一路徑，通常不能直接合成最終藥物，而是先合成中間體4AD和ADD，它們的結構式如圖2所示，通過中間體再進一步可合成幾乎所有的已知甾體類藥物。該法的主要過程包括：通過微生物將甾醇C3位的羥基氧化為酮基；再將C5位的雙鍵引入C4位，同時降解C17位的側鏈得到AD；在此基礎上還原C1位引入雙鍵得到ADD。相關研究主要以谷甾醇、麥角甾醇和混合植物甾醇為原料，見表1。

圖2 4-雄烯二酮和1，4-雄二烯二酮Fig.2 The structures of 4-androstene-3，17-dione and androsta-1，4-diene-3，17-dione

表1 以甾醇為底物微生物法合成AD和ADD的主要研究Table 1 Microbial synthesis of AD and ADD using sterols

然而，目前通過AD或ADD合成最終藥物的多為化學法[14]，僅有少數藥物可實現全工藝生物法合成。具有代表性的是：通過Mycobacterium sp.NRRL B-3805催化膽固醇合成睪丸酮[6]；以谷甾醇為原料合成黃體酮[14]；以羊毛甾醇為原料合成C-21甾體或強心苷元[1]。

此外，羽扇豆醇、α-和β-香樹脂醇等普通植物油中不常見的甾醇，被發現是合成三萜類化合物的重要底物。例如，β-香樹脂醇是合成甘草次酸、齊墩果酸、大豆皂醇、柴胡皂苷的原料；α-香樹脂醇是合成熊果酸、烏索酸的原料；羽扇豆醇是合成樺木酸的原料[12，24-29]。

2 以甾醇為原料合成甾醇酯

2.1 甾醇酯的主要應用

甾醇酯被人所認知是從它的降膽固醇功能開始的，隨后人們發現它具有降低心血管發病率、抗炎、抗癌等一系列功效，因而開始大力開發這一資源[30]。甾醇酯的使用歷史晚于甾體類藥物，且其主要被應用于食品和保健品領域。1999年，日本農林省批準甾醇/甾烷醇酯為保健食品FOSHU的添加劑；2000年，美國食品藥品監督管理局發布公告稱從膳食中攝入甾醇/甾烷醇酯可降低膽固醇；2004年，歐盟委員會批準甾醇酯可以作為黃油涂醬、奶制品的原料；2010年，我國衛生部發布第3號公告批準植物甾醇酯作為新資源食品，對于含量90%的植物甾醇酯建議每日食用量不高于3.9 g（嬰幼兒除外）[31]。目前，主要將甾醇酯作為抗氧化劑、乳化劑等應用于食品和保健品之中，以提高該類產品的氧化穩定性和營養功能[32]。

甾醇酯可通過結晶、蒸餾等技術從油脂加工副產物中提取[33]，例如可從谷物油脂（米糠油、玉米胚芽油等）的皂腳、脫臭餾出物中提取谷甾醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯、24-亞甲基環木菠蘿醇阿魏酸酯、環木菠蘿醇阿魏酸酯等，其中后兩者是谷維素（米糠油的特征營養物質）的主要成分[10，34-35]。然而通過提純這些天然甾醇酯的產量遠遠不能滿足需求，因而對于甾醇酯合成技術的開發成了目前的研究熱點。

2.2 典型合成研究

20世紀70年代，已開發出采用甾醇酰基轉移酶催化混合植物甾醇制取甾醇酯的技術[36]。由于微生物法的反應底物基本為從油脂加工副產物中提煉的混合植物甾醇，因此一直以來將研發重點放在酶的改進和脂肪酸的選擇上，相關研究見表2。

表2 以甾醇為底物微生物法合成甾醇酯的典型研究Table 2 Microbial synthesis of sterol esters using sterols

然而混合植物甾醇中各單體往往具有各自最適的反應條件，這也限制了甾醇酯的高效合成，故以單一甾醇為原料的合成技術開始受到學者青睞。近年來，隨著甾醇單體分離技術的提高，部分單體如β-谷甾醇已經實現工業化生產，相應谷甾醇酯的合成技術也得到不斷發展。

然而，甾醇酯的微生物合成最大瓶頸在于酶的高效利用，而這又與酶的存在形式和反應體系息息相關，因此最新研究集中在采用固定化酶，或選擇離子液體、超臨界流體等新體系[44-45]。

3 結論

甾體類化合物在食品、保健品和藥品領域有著舉足輕重的作用，按用途主要分為甾體類藥物和甾體類功能食品。其中甾體類藥物已是僅次于抗生素的第二大類用藥；而甾體類功能食品以甾醇酯為代表，近年來在食品、保健品領域頗受關注。傳統合成甾體類化合物的方法因存在步驟繁多、污染嚴重、條件苛刻等問題，逐漸被環保、具特異性的微生物法所取代。合成原料也從日益緊缺的植物皂素資源轉為產量豐富的油脂加工副產物甾醇。目前，以甾醇為底物用微生物法合成甾體類藥物一般只能合成至中間體AD和ADD，合成最終產物的技術還有待突破；而合成甾醇酯則亟需培育針對不同甾醇（或甾醇混合物）的微生物及選擇相應的反應體系，這是實現工業化的前提。

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