LC-ESI-MS/MS測定白酒中甜味劑紐甜的方法研究

周玉，董孝元，余義，劉莎，唐艷榮，陳佳麟，時宏偉，*

（1.武漢天龍黃鶴樓酒業有限公司，湖北武漢430050；2.健民藥業集團股份有限公司，湖北武漢430050）

甜味劑是改善食品口味的一種食品添加劑，有著低熱量、高甜度、適合糖尿病病人適用等特點而成為蔗糖替代品在食品中廣泛使用。紐甜是一種新型的非營養高倍甜味劑，甜度為蔗糖的7 000倍～13 000倍，口味純正，甜感清爽，持續時間長，紐甜的安全性、有效性、穩定性、經濟性及環保性等多方面的系統評價得出紐甜為可取代阿斯巴甜且具廣闊應用前景的二肽類甜味劑[1-4]。甜味劑盡管應用范圍很廣，但是在白酒中是不允許添加的[5]。

白酒是我國的傳統蒸餾酒，按其風味特征可分為各種不同的香型，雖然每種香型各有其典型風格，但是不論哪種香型的白酒，保持適度的甜味，不僅可以遮蓋其他一些苦澀雜味，而且還能使酒體甘冽、醇厚、綿軟，但是這種甜味是來自于自然發酵產生的，而非添加甜味劑。風味化學研究表明，味覺是由一定的呈味物質引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因為酒中含有一定量的甜味物質，如高級醇、多元醇、氨基酸等，這些甜味物質，對于名優白酒，是由其特殊的生產工藝決定的，如濃香型大曲酒的低溫入池、緩慢發酵，就是為了有利于醇甜物質的生成，無需另行添加[6-10]。

人工合成甜味劑可能對人體有致癌、致病的副作用[6]，因而已被許多國家限制使用。尤其在白酒行業，GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規定白酒中甜味劑不得檢出。所以對于白酒中甜味劑的測定應該做到嚴格把關，防止行業和白酒企業中出現假冒偽劣產品，對消費者產生不利影響。目前，關于紐甜的檢測方法主要有液相色譜-質譜聯用法[11-17]、高效液相色譜法[18-19]、離子交換色譜法[20]、毛細管電泳法[21]、氣相色譜法[22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紐甜（規格100 mg，儲存溫度-20℃）：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇（色譜純）：美國Baker公司；乙酸（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；蒸餾水（規格600 mL）：廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷倫三重串聯四級桿質譜儀、Agilent ZORBAX RX-C18安捷倫色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；有機濾膜（孔徑0.22 μm）、全玻璃微孔過濾器（規格1 000 mL）：天津津騰實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取10 mg（精確至0.000 1 mg）紐甜標準品于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至100 mL），配制成100 mg/L的標準儲備液，置于4℃冰箱中保存。根據使用需要用蒸餾水逐級稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

1.3.2 樣品前處理方法

用一次性注射器吸取均質樣品，經0.22 μm的有機濾膜過濾，濾液供液相色譜-質譜聯用儀測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 為 0.1%乙酸溶液，B 為甲醇；流動相體積比：A ∶B=20 ∶80；流速：0.4 mL/min；柱溫箱：25 ℃；進樣量：2 μL。

1.3.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測模式；干燥氣體溫度：325℃；干燥氣體流速：6 L/min；噴霧電壓：206.8 kPa。

2 結果與討論

2.1 色譜條件和質譜條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化

采取直接進樣的方式，將目標物標準溶液注入質譜，分別進行正離子模式和負離子模式全掃描檢測，得到一級質譜圖和準分子離子峰，再用惰性氣體氮氣攻擊該母離子，獲得其二級質譜圖及相應的子離子。結果表明在正離子模式下響應值及靈敏度均高于負離子模式，因此，本方法選擇正離子電離模式。利用多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM））對選定的定性離子和定量離子對碎裂電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質譜參數進行優化，使各監測離子豐度和信號達到最佳。正離子模式下的質譜分析參數見表1。

表1 紐甜的質譜參數Table 1 Mass parameters for analysis of neotame

2.1.2 色譜條件的優化

分別以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進行樣品分離。結果表明，用0.1%乙酸-甲醇作為流動相時物質分離度、峰形、響應值以及保留時間的穩定性均優于0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨-甲醇，故本方法最終選用0.1%乙酸-甲醇為流動相進行洗脫。紐甜在優化的色譜和質譜條件下的MRM色譜圖，見圖1。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

線性范圍、檢出限和定量限參照Gan Zhiwei，Pro bir Kumar Ojha等[23-24]的方法，將紐甜標準儲備液用蒸餾水稀釋，分別配制成5種濃度為50、100、200、500、1 000 μg/L的標準工作液，按1.5節所述的色譜-質譜條件進行測定，繪制標準工作曲線，見圖2。

圖1 紐甜的多反映監測色譜圖Fig.1 Chromatogram of neotame in MRM mode

圖2 紐甜的線性相關系數Fig.2 Linear correlation coefficients of neotame

結果顯示，在50 μg/L～1 000 μg/L的濃度范圍內，所有分析物的質量濃度x（μg/mL）和響應值y之間線性相關系數為0.999 99；以性噪比為3確定檢出限為50 μg/L，以性噪比為 10 確定定量限為 200 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率參照 H.Ozer，Elisabeta-Irina Geana等[25-26]的方法，采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，選擇常見的濃香型和兼香型兩個不同香型白酒酒樣及乙醇進行的紐甜檢測試驗，成品白酒1、2和乙醇3的紐甜含量均為未檢出，并向兩個樣品中分別添加200、500 μg/L二個濃度水平的紐甜進行回收率實驗，重復測定2次。共6組平行，12次檢測，結果表明，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的相對偏差小于2%，且回收率均在85%～105%率范圍內，所以該方法的精密度和回收率均符合相關標準要求。

2.4 與國標法比對

選擇常見的4種不同類型白酒酒樣添加紐甜，將本方法與國標GB 5009.247-2016《食品安全國家標準食品中紐甜的測定》方法進行加標測回收率結果比對，比對結果見表2。

表2 方法結果比對Table 2 Comparison of methods

將本方法和國標方法的數據進行比較，兩組數據的絕對偏差小于1，相對偏差小于5%。國標方法中紐甜的定量限是0.2 mg/L；本方法的檢出限是0.05 mg/L，定量限是0.2 mg/L。結果表明，本方法可以用于白酒中紐甜的檢測。相比液相色譜系統，液相質譜聯用儀具有更高的分離度和靈敏度以及更短的檢測時間。

3 結論

本研究利用液相色譜-質譜聯用儀分析了白酒中甜味劑紐甜化合物的分子信息，利用多反應監測模式的液相色譜-質譜聯用儀技術，建立了一個快速、穩定、靈敏的可定性定量紐甜的方法。該方法可在15 min內完成，其檢測范圍內線性良好（r=0.999 99）；檢出限0.05 mg/L；定量限 0.2 mg/L；精密度＜2%；回收率＞85%；且與國標中的檢測方法相比檢出限更低，能更加有效的監控白酒中紐甜的含量，綜上所述該方法可以對紐甜進行實際的定性定量檢測。

[1]姚明靜,季斌,劉麗萍,等.白酒中常見的七種甜味劑檢測方法及來源的研究進展[J].釀酒科技,2017(5):1-6

[2]朱明婧,劉博,李飛飛.天然甜味劑研究進展與開發前景分析[J].中國調味品,2015(11):136-140

[3]楊雙春,劉慧芳,王健,等.國內外人工合成的非能量型甜味劑研究現狀[J].食品工業,2013(4):181-184

[4]Bryant Charlotte,Mclaughlin John.Lowcalorie sweeteners:Evidence remain slacking for effects on human gut function[J].Physiology&behavior,2016(14):62-64

[5]楊君,王建華,劉靖靖,等.食品中甜味劑的檢測技術研究進展[J].化學分析計量,2013(5):100-103

[6]孫棣,馮永渝,梁桂娟.白酒中甜味劑的檢測及其來源的探討[J].中國釀造,2015(7):142-146

[7]Zhu L,Wang G,Dong B.Effects of sweetener neotame on diet preference,performance and hematological and biochemical parameters of weaned piglets[J].Animal Feed Science and Technology,2016(5):14

[8]M C Yebra-Biurrun.Sweeteners[M].Netherlands:ElsevierInc,2013:12-13

[9]劉石雪,唐麗云.高效液相法測定白酒中紐甜含量影響因素的探究[J].釀酒科技,2017(6):9-11

[10]潘紅,邢卉研,胡麗,等.液相色譜質譜聯用儀同時測定白酒中5種甜味劑含量[J].科技經濟導刊,2016(7):100-101

[11]吳世嘉,王洪新,陶冠軍.超高壓液相色譜—質譜同時測定白酒中6種微量甜味劑的方法研究[J].食品與生物技術學報,2010,29(5):670-675

[12]王麗,俞心愉,李磊.超高效液相色譜-高分辨質譜法快速檢測白酒中4種甜味劑[J].中國衛生檢驗雜志,2014,24(22):3244-3246,3250

[13]梅婕,司冠儒,張溫清,等.高效液相色譜-串聯質譜法測定白酒中6種甜味劑[J].釀酒科技,2016(3):122-124

[14]Jian-YeGUI,Wei SUN,Chen-Ling ZHANG,et al.An Innovative Approach to Sensitive Artificial Sweeteners Analysis by Ion Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2016,44(3):32-33

[15]Romina Shah,Samantha Farris,LowriS DeJager,et al.Anovel method for the simultaneous determination of 14 sweeteners of regulatory interest using UHPLC-MS/MS[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2015,32(2):12-14

[16]牛之瑞,王秀君,于毅濤,等.液相色譜-質譜聯用同時測定白酒中8種甜味劑[J].食品科學,2016(2):178-181

[17]Hiroaki Sakai,Azusa Yama shita,Masayoshi Tamura,et al.Simultaneous determination of sweeteners inbeverages by LC-MS/MS[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2015,32(4):62-63

[18]劉芳,王彥,王玉紅,等.固相萃取-高效液相色譜-蒸發光散射檢測法同時檢測食品中5種人工合成甜味劑[J].色譜,2012(3):292-297

[19]Kakigi Y,Suzuki T,Icho T,et al.Classification of stevia sweeteners in soft drink susing liquid chromatography and time-of-flight mass spectrometry[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2013,30(12):21-22

[20]桂建業,孫威,張辰凌,等.離子色譜-串聯質譜法分析環境水體中痕量人工甜味劑[J].分析化學,2016(3):361-366

[21]薛洪寶,張暉,梁麗麗,等.高效毛細管電泳法測定食品中5種甜味劑含量[J].食品與生物技術學報,2014(3):315-320

[22]阮麗萍,蔡梅,吉文亮,等.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定調味品中8種人工合成甜味劑[J].中國食品衛生雜志,2013(4):331-335

[23]Gan Zhiwei,Sun Hongwen,Wang Ruonan,et al.Anovel solid-phase extraction for the concentration of sweeteners in water and analysis by ion-pair liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2013(4):52-55

[24]Probir Kumar Ojha,KunalRoy.Development of arobust and validated 2D-QSPR model for sweetness potency of diverse functional organic molecules[J].Food and Chemical Toxicology,2017(1):32-36

[25]Ozer H,Psimouli V,Ozcan N,et al.Oreopoulou.Ringtrial for the simultaneous analysis of sweeteners and preservatives in soft drinks[J].QualityAssuranceandSafetyofCrops&Foods,2013,5(1):6-12

[26]Elisabeta-Irina Geana,Andreea-Maria Iordache,Roxana Elena Ionete.Simultaneous determination of artificial sweeteners in possible counter feited wines,using high performance liquid chromatography with DAD detection[J].Analele Universitatii“Ovidius”Constanta-Seria Chimie,2012,23(1):14-17