廣藿香原生質體制備、培養與融合技術優化研究

嚴寒靜 李磊 張宏意 何夢玲

摘 要：為建立高效穩定的廣藿香原生質體培養與融合技術體系，該研究以廣藿香愈傷組織懸浮細胞為材料，研究了原生質體制備的酶解條件和培養方法、細胞密度、激素種類和濃度等因素對原生質體培養的影響，并通過測定融合產物直徑確立融合細胞篩選范圍，進一步研究聚乙二醇濃度、細胞密度、融合時間及融合液加入量等因素對原生質體融合的影響。結果表明：制備原生質體的適宜條件為pH5.8，酶解溫度25 ℃;原生質體培養以銨鹽減半的MS1培養基進行海藻酸鈉包埋、激素選用0.2 mg·L-1 NAA、2.0 mg·L-1 6-BA，培養密度2.0×105個·mL-1、蔗糖添加量1.0%、酸水解酪蛋白500 mg·L-1的條件下原生質體分裂頻率、植板率均較高，且開始分裂時間和細胞團形成時間都較短;雙細胞融合產物篩選范圍為69.33～87.35 μm;以40% PEG 6000化學促融30 min、加入0.5倍體積的融合液、細胞密度2.0×105個·mL-1的條件進行原生質體融合，聚合率可達57.19%;獲得的融合產物經海藻酸鈉包埋培育2個月后可觀察到再生愈傷組織。

關鍵詞：廣藿香，聚乙二醇，原生質體制備，原生質體融合，新品種選育

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）10-1310-09

Abstract：For establishing a high efficient and stable protoplast culture and fusion technology system，the protoplasts obtained from Pogostemon cablins callus，were studied as the material for enzymatic hydrolysis conditions of protoplast preparation，and on this base，the effects of culture methods，cell density，hormone types and concentrations on the protoplast culture were studied. Screening range of fusion cells was determined by measuring the diameter of fusion products. The effects of PEG concentration，cell density，incubation time and amount of fusion fluid on the fusion rate of protoplasts were studied by single factor analysis. The results showed that? the vitality of protoplast reached the highest value at 25 ℃ and the optimal pH for enzymatically hydrolyzing was 5.8. The improved medium MS1，which consisted half of ammonium salt（NH4NO3 825 mg·L-1），added the hormones about 0.2 mg·L-1 NAA and 2.0 mg·L-1 6-BA was used to embed in sodium alginate. With the conditions of 2.0×105 protoplasts·mL-1 of the cell density，1% sucrose content and 500 mg·L-1 acid hydrolyzed casein，protoplasts got into division and formation of cell clusters earlier and had the higher division frequency and plating efficiency. The range of double cell fusion products was 69.33-87.35 μm; 40% PEG 6000 was selected to promote the chemical fusion. With the increase of fusion time，cell density and amount of fusion liquid，both polymerization rate and polycondensation rate increased. With 0.5 times volume of the fusion solution，2.0 × 105 protoplasts·mL-1 of the cell density and 30 min of fusion time，the polymerization rate was up to 57.19%. After two months embedding cultivation，the callus was observed.

Key words：Pogostemon cablin，PEG，protoplast preparation，protoplast fusion，breeding

廣藿香（Pogostemon cablin）為唇形科刺蕊草屬植物，是廣東的道地藥材，具芳香化濁、和中止嘔、發表解暑之功效（國家藥典委員會，2015）。現代藥理學研究表明，廣藿香可以調節胃腸道功能并具有抗菌作用（羅集鵬等，2005;莫小路等，2004），是多種中成藥的主要原料。此外，廣藿香油中的百秋里醇氣味獨特宜人，并可使香味持久，是法國標準化委員會確定的香精香料中的標志性成分，被廣泛應用于日用品和化妝品中（吳友根等，2010）。廣藿香自引種到我國南亞熱帶地區種植后，很少或者根本沒有經過遺傳改良，種質退化嚴重，個體間藥用活性成分和產量差異極顯著，導致了藥材質量不穩定和不可控。解決問題的根本措施之一是開展品種改良或新品種的選育，但是，由于廣藿香在我國為無性繁殖，傳統育種舉步維艱，需要引入新技術和新方法，進行種質資源的創新工作。

原生質體具有再生成完整植株的能力，是進行細胞器分離、轉基因和基因功能分析等研究的理想材料，也是以細胞雜交方式培育新品種的必備材料（Eeckhaut et al，2013）。在中藥材品種篩選和種質改良方面，原生質體融合是誘導細胞雜交和增加染色體組倍性行之有效的途徑之一。目前植物原生質體制備和融合大多以酶解法制備原生質體、PEG誘導原生質體融合（Mackwska et al，2014; Mori et al，2014; 彭小群等，2015），而酶液組成、酶解時間和滲透劑組成是影響酶解法制備原生質體的主要因素（Hongoh et al，2003），PEG濃度和融合時間是影響PEG誘導原生質體融合的主要因素（Durieu & Ochatt，2000）。探明這些因素對原生質體制備和融合過程的影響，是系統建立起原生質體制備和融合技術體系的重要保證。本研究以性狀優良的石牌廣藿香為材料，在前期對廣藿香懸浮細胞原生質體的分離與純化研究的基礎上（梁威等，2016），考察不同的培養方法、培養基組成等對廣藿香原生質體培養的影響，并著重研究PEG濃度、孵育時間等對原生質體融合的影響，以期篩選出PEG誘導廣藿香原生質體融合的最適條件，為系統建立廣藿香的原生質體融合技術體系奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

所用材料采自廣東藥科大學藥用植物園，由姬生國教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香（Pogostemon cablin）。試劑：熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA）為Solarbio公司產品，纖維素酶（cellulase）、半纖維素酶（hemicellulase）、果膠酶（pectinase）為Sigma公司產品，其它生化試劑為國產的分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養基配制 混合酶液的配制參考梁威等（2016）的方法，原生質體清洗液（CPW-4M）按朱至清（2003）的方法配制。以MS為基本培養基，此外添加0.4 mol·L-1甘露醇、0.1% 嗎啉乙磺酸（MES）、0.1%肌醇、不同濃度的蔗糖或葡萄糖、生長調節劑、酸水解酪蛋白等。低熔點瓊脂糖培養基：1.2%瓊脂糖、0.1% MES、pH 5.8。海藻酸鈉溶液：1.5%海藻酸鈉，以無鈣原生質體培養液（不含CaCl2）為溶劑，90 ℃高壓滅菌20 min。PEG融合液：10 mmol·L-1 CaCl2·2H2O、0.7 mmol·L-1 KH2PO4、0.1 moL·L-1甘露醇、30%～50% PEG 6000，pH 5.8，溶液過0.45 μm微孔濾膜后4 ℃保存，使用前過0.22 μm微孔濾膜脫菌。高pH高鈣洗液參考Kao & Michayluk（1974）的方法配制。FDA母液：取5 mg FDA溶于1 mL丙酮中，0 ℃以下保存。以上試劑除特別提到，均在121 ℃下高壓滅菌后備用。

1.2.2 愈傷組織誘導與懸浮培養 以石牌廣藿香為外植體，接種于MS+0.05 2，4-D+0.5 KT（單位為mg·L-1，下同）固體培養基，光照12 h·d-1、光強1 500 lx、（25±2） ℃條件下培養，誘導廣藿香愈傷組織。選取疏松淡黃色愈傷組織，轉入液體培養基中進行懸浮培養，轉速135 r·min-1，接種量70 g FW·L-1，繼代周期24 d。

1.2.3 原生質體制備

1.2.3.1 酶液pH和酶解溫度的篩選 懸浮細胞依次過40、100目篩網，收集后按1∶10（m/v）加入不同pH值的混合酶液以考察酸堿度對分離的影響;設置23、25、28、30 ℃ 4個溫度梯度，50 r·min-1避光振蕩酶解12 h，考察溫度對酶解制備原生質體的影響。通過統計分析，確定廣藿香原生質體制備的酶液pH和酶解溫度。

1.2.3.2 原生質體純化收集 酶解液依次過40、100、200目篩網，收集濾液1 000 r·min-1離心3 min去上清，沉淀加適量CPW-4M液混勻后再次離心并去上清，重復3次后，沉淀轉移至原生質體培養液中保存。

1.2.4 產量與活力的測定 將1.2.3.2中得到的原生質體溶液滴加在血球計數板上，計算原生質體數，其密度與產量計算公式如下。實驗重復不少于3次，鏡檢時不同視野測量次數≥5，每個樣品測量值取5次測量的均值（下同）。

原生質體密度（個·mL-1）=5個大格內原生質體總數×5×10 000×稀釋倍數;原生質體產量（個·g-1）的計算公式如下：

原生質體產量=原生質體密度×稀釋后體積細胞生物量（g）。

原生質體活力參考Widholm（1972）的方法，在熒光顯微鏡下測定，公式如下：

原生質體活力=暗視野下發熒光原生質體數明視野下原生質體數×100%。

1.2.5 原生質體培養 考察液體淺層培養、瓊脂糖包埋培養、固液雙層培養、海藻酸鈉包埋培養4種方法對原生質體培養的影響，培養密度為2×105個·mL-1，培養基為MS1+0.2 NAA+2.0 6-BA+1.0%蔗糖+500 mg·L-1酸水解酪蛋白。

確定培養方法后，再考察培養密度（分別為1.0×105、2.0×105、4.0×105、6.0×105個·mL-1）和培養基組分（包括激素、銨鹽、碳源、酸水解酪蛋白）（表3和表4）對原生質體培養的影響，以分裂頻率與植板率為考察指標，計算公式如下：

分裂頻率=視野內發生分裂的再生細胞數視野內細胞總數×100%;

植板率=視野內細胞團數視野內細胞總數×100%。

1.2.6 原生質體融合 采用高pH高鈣法融合原生質體，將分離純化后的原生質體懸浮于適量CPW-4M液中，離心洗滌并調整至不同密度（0.5、1.0、2.0、3.0×105個·mL-1），于培養皿中靜置15 min;緩慢滴加30%、40%、50%的PEG 6000融合液，加入量為原生質體懸浮液體積的不同倍數（0.2、0.5、1.0、2.0倍），靜置5 min;再滴加融合液2倍量的高pH高鈣洗液，靜置時間為10～40 min;混合液離心后去上清，重復3次;鏡檢并測量正常形態的細胞直徑，計算聚合率、多聚率，公式如下：

聚合率=雙細胞聚合的原生質體數總原生質體數×100%;

多聚率=3個及3個以上細胞聚合的原生質體數總原生質體數×100%。

1.2.7 融合產物的篩選 參考Hao et al（2002）的方法得到剛分裂生成的子細胞（NDC）的直徑RD和中期細胞的直徑RM之間的關系為RD=0.793 7RM。分別在原生質體培養6～7 d時（子細胞多），測量并統計NDC細胞直徑，計算RD平均值;培養10～12 d時（中期細胞多），測量并統計以計算RM平均值，每次觀察100個以上可準確測量直徑的細胞。

參考劉劍鋒等（2010）的方法，可知2個原生質體融合后產物最小直徑Rmin與最大直徑Rmax。比對細胞直徑，一般非融合單細胞直徑（RD-RM）<雙細胞融合產物直徑（Rmin-Rmax），若直徑大于Rmax，則為3個細胞以上的融合產物。

2 結果與分析

2.1 酶解條件對原生質體制備的影響

在我們前期的實驗中，已經對廣藿香原生質體制備的酶液組合、酶解時間、滲透壓調節劑甘露醇濃度等條件進行了系統研究（梁威等，2016），本文在此基礎上，進一步考察酶解溫度和酶液pH值對酶解后原生質體活力和產量的影響（圖1）。結果表明，在pH 5.8時，酶解分離后獲得的廣藿香原生質體產量最高;在pH 5.8～6.2時，原生質體活力較高。結合產量與活力數據，選擇pH 5.8為廣藿香細胞壁酶解的最適pH值。

酶解溫度在23～28 ℃時，原生質體產量較高;在25 ℃時，原生質體活力達到最高值，溫度過高或過低活力都有所下降。綜合產量與活力數據，選擇25 ℃為廣藿香細胞壁適宜的酶解溫度。

2.2 不同因素對原生質體培養的影響

2.2.1 不同培養方法對原生質體培養的影響 采用液體淺層、固液雙層、瓊脂糖包埋與海藻酸鈉包埋4種方法對原生質體進行培養。每天鏡檢觀測，統計結果見表1。從表1可以看出，液體淺層與固液雙層培養雖然分裂頻率與植板率都較高，但最終并未觀察到愈傷組織形成;瓊脂糖包埋與海藻酸鈉包埋的培養方法最終都形成了愈傷組織，其中海藻酸鈉包埋開始分裂時間較早，分裂頻率與植板率較高，因而選擇海藻酸鈉包埋法進行廣藿香原生質體培養。

2.2.2 不同細胞密度對原生質體培養的影響 設計1.0×105、2.0×105、4.0×105、6.0×105個·mL-1? 4個不同的細胞密度進行原生質體培養，結果見表2。當細胞密度為2.0×105個·mL-1時，分裂頻率與植板率都達到最高，且未出現褐化情況。因此，可選擇細胞密度為2.0×105個·mL-1。

2.2.3 不同激素對原生質體培養的影響 考察了NAA、2，4-D、6-BA不同組合、不同濃度對原生質體培養的影響，結果見表3。當6-BA為2.0 mg·L-1、NAA為0.2 mg·L-1時，原生質體分裂頻率與植板率最高，為最適激素濃度與配比。

2.2.4 其它因素對原生質體培養的影響 考察了銨鹽、碳源及水解酪蛋白濃度對原生質體培養的影響，結果見表4。銨鹽分別取MS培養基原銨鹽濃度（MS：NH4NO3 1 650 mg·L-1）、減半濃度（MS1）和不加銨鹽（MS0）3個梯度進行比較，結果發現，MS1培養基中原生質體分裂頻率、 植板率均較高，且開始分裂時間和細胞團形成時間都較短，因此最佳銨鹽濃度為NH4NO3 825 mg·L-1（MS1）。碳源分別選擇了0.5%、1.0%、2.0%的蔗糖與1.0%的葡萄糖，以MS1培養基進行海藻酸鈉包埋培養，結果發現，葡萄糖作為碳源未觀察到細胞分裂;而蔗糖含量為1.0%時，細胞開始分裂時間與形成細胞團時間均較早，分裂頻率與植板率都較高，為最佳濃度。酸水解酪蛋白對原生質體培養起一定促進作用，本研究設定了0、200、500、800 mg·L-1 4個濃度梯度進行實驗，結果發現，酸水解酪蛋白濃度為500 mg·L-1時，細胞分裂時間較早，分裂頻率與植板率較高，為最適濃度。

2.3 不同因素對原生質體融合的影響

2.3.1 融合產物篩選范圍 經測量與統計，單個廣藿香原生質體直徑為51.74～69.33 μm;經公式推導，融合產物直徑為65.19～87.35 μm;剔除交集部分，雙細胞融合產物篩選范圍為69.33～87.35 μm。

2.3.2 PEG濃度對原生質體融合的影響 考察30%、40%、50%的PEG 6000對原生質體融合的影響，結果表明當PEG 6000濃度為40%、50%時，聚合率較高，分別為56.24%和57.44%，兩者間差異不顯著;但當濃度為50%時，多聚率達到13.74%，明顯高于前者，且該處理較多原生質體融合為三聚體、多聚體及樹枝狀結構（表5）。因此，PEG 6000的濃度選擇40%為宜。

2.3.3 細胞密度、融合時間及融合液加入量對原生質體融合的影響 融合時間、細胞密度和融合液加入量對原生質體融合的影響見表6。表6結果表明，隨著融合時間的增加，聚合率與多聚率都隨之增加，融合30 min與40 min的聚合率沒有顯著差異，但40 min時多聚率明顯增加，因此融合時間以30 min為宜;而隨著細胞密度的增加，聚合率與多聚率都隨之增高，以較高聚合率與較低多聚率為考察標準，選擇2.0×105個·mL-1作為最適融合細胞密度;隨著融合液加入量的增加，多聚率不斷提高，從統計分析比較結果來看，融合液與細胞液體積比選擇0.5或1.0較為合理，按照最佳效果最低濃度原則，選擇0.5倍融合液為最適加入量，此條件下聚合率達57.19%，多聚率為9.2%。

按照上述原生質體的最適制備、最適培養及融合條件，進行廣藿香廣藿香原生質體制備、培養及融合，得到了形態及生長發育良好的單細胞及雙細胞融合原生質體（圖版Ⅰ）。融合產物經海藻酸鈉包埋培育2個月，觀察到愈傷組織再生。

3 討論

3.1 原生質體培養

本研究考察了多種培養方法對廣藿香原生質體培養的影響，結果表明海藻酸鈉包埋培養的方法最好。此方法屬于固體培養，能避免液體培養原生質體不固定、不易跟蹤觀察的缺點。作為一種高分子化合物，海藻酸鈉質地柔軟、均一，相對于瓊脂糖，屬于軟包埋原生質體的培養方式，可以避免瓊脂糖包埋時熱激（heat shock）對原生質體的傷害（賈士榮等，1988）。雖然液體培養與固液雙層培養的原生質體更早分裂，并有較高的分裂頻率和植板率，但最終都未形成愈傷組織，可能是隨著原生質體分裂后細胞數量增多，間距顯著減小，代謝產物所產生的相互毒害作用愈加嚴重所致。

本研究中，廣藿香原生質體培養時的最佳細胞密度為2.0×105個·mL-1，楊茹（2010）認為細胞密度一般應控制在104～105個·mL-1，與本研究結果一致。原生質體生長受到細胞密度影響往往是雙向的，若密度過低，促進原生質體分裂的內源性物質濃度較低，將導致原生質體不能持續分裂（陳名紅等，2007）;若密度過高，由于養分缺失或有害細胞代謝物積累，將會阻礙再生細胞正常生長。

培養基組分中氮源的種類和濃度對原生質體培養有重要影響，普遍認為銨態氮對原生質體是有一定毒害作用的，應盡量減少以避免傷害。廣泛應用于組織培養的MS培養基中NH4NO3含量為1 650 mg·L-1，而常用于原生質體培養的KM8P培養基NH4NO3含量為600 mg·L-1（Kai & Michayluk，1975），以及NT培養基NH4NO3含量為825 mg·L-1（Nagata & Takebe，1971），銨鹽含量都有所調低;本實驗在進行銨鹽含量考察時，設置了不添加NH4NO3的比較梯度，結果顯示無銨態氮的培養基并不利于原生質體生長，說明銨態氮對于廣藿香原生質體培養仍然是必不可少的，其濃度可能需要根據物種的不同進行相應調整;而當NH4NO3濃度為825 mg·L-1，廣藿香原生質體生長較好，與NT培養基中銨態氮含量一致。

3.2 原生質體融合

本研究采用了PEG-高pH高鈣法進行廣藿香的原生質體融合，同時研究了細胞密度、融合時間及融合液加入量對融合的影響。PEG-高pH高鈣法是已有的原生質體融合方法中應用較多的一種，含有醚鍵的PEG具有負極性，與水、蛋白質、糖等正極化基團形成氫鍵，鏈狀的PEG聚合物可充當相鄰原生質體表面間的分子橋而使其粘連（Kao & Michayluk，1974）;植物原生質體表面電荷在-10～-30 mV之間，高pH高濃度鈣離子可以中和膜表面負電荷（李浚明，2005）;洗滌過程中，含有較高濃度Ca2+的洗液可以使原生質體膜上具有負極性的PEG分子洗脫，原生質體表面電荷因而重新分配，促進了原生質體融合。PEG濃度、細胞密度、融合液加入量對原生質體融合有著相似的影響作用。實驗發現，隨著PEG濃度、融合時間、細胞密度和融合液加入量的增加，聚合率與多聚率都隨之增加;推測一開始作用較弱時，原生質體融合不徹底，融合率低;各影響因素增強后，較多原生質體融合為三聚體、多聚體與樹枝狀結構，多聚率偏高。因此需要對影響原生質體融合的各因素進行篩選。

本研究以物理選擇法進行了融合產物篩選，在測量中期細胞直徑時，參考熊洋等（2013）的方法處理廣藿香原生質體，未觀察到細胞分裂中期的細胞，可能是由于懸浮細胞全日光照培養，擾亂了細胞正常生長規律，細胞個體間分裂同步性差，從而使短暫的分裂中期時刻不易被大量捕獲。為了得到單個廣藿香懸浮細胞直徑范圍，最后選用了以測量NDC細胞直徑與驗證公式相結合的方法來使中期細胞直徑測量值在準確范圍內。