春性甘藍(lán)型油菜BnFY34基因的克隆及序列分析

趙宏魁 殷恒霞 胡桂蓮 羅玉秀 周華坤 石國璽 姚步青

摘 要：? 春性甘藍(lán)型油菜雜交種由于發(fā)育期較長，極大地限制了該油菜在高寒地區(qū)的推廣。為了從春性特早熟甘藍(lán)型油菜中篩選出苗期和蕾期差異表達(dá)的基因，該研究以春性特早熟甘藍(lán)型油菜為材料，利用cDNA-AFLP技術(shù)篩選出1個(gè)春性特早熟甘藍(lán)型油菜苗期特異表達(dá)的基因片段，并采用RACE技術(shù)成功分離克隆了該基因，命名為BnFY34。通過對該基因的測序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因序列大小為455 bp，包含完整的開放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)由71個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，推測的蛋白質(zhì)分子量為8.04 kD，理論等電點(diǎn)為10.25，其三級結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)α螺旋，不含β折疊。同時(shí)，將BnFY34基因與甘藍(lán)型油菜基因組序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示BnFY34基因位于C4染色體上，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。另外，通過對該基因與其他植物同源基因的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明BnFY34基因與蕓薹屬植物屬于同一亞族，并且與甘藍(lán)型油菜中已報(bào)到的未詮釋基因XM_013837282.1的相似度達(dá)100%，其功能有待進(jìn)一步研究。該研究結(jié)果對春油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的早熟轉(zhuǎn)基因育種具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 甘藍(lán)型油菜， 發(fā)育， 基因表達(dá)， cDNA-AFLP

中圖分類號：? Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2018）01-0084-06

Clone and sequence analysis on gene BnFY34 from spring rapeseed （Brassica napus）

ZHAO Hongkui1，2， YIN Hengxia3*， HU Guilian1， LUO Yuxiu4， ZHOU Huakun2， SHI Guoxi2， YAO Buqing2

（ 1. Hainan State Ethnic Minority Science and Information Center， Qiabuqia 813099， Qinghai， China; 2. Northwest Plateau Institute of Biology， Chinese Academy of Sciences， Key laboratory of restoration ecology of cold area in Qinghai Province， Xining 810008， China; 3. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture， Qinghai University， Xining 810016， China; 4. College of Ecological Environment and Engineering， Qinghai University， Xining 810016， China ）

Abstract：? Rape， belonging to Brassica （Cruciferae）， is an important oil crop widely cultivated in China due to its wide adaptability. Spring rapeseed （Brassica napus） is widely cultivated in Qinghai Province due to its high yield and quality， however， it has been greatly restricted the promotion of rape in alpine region because of its long development period. Therefore， screening differentially expressed genes in seedling and bud stages plays an important role in early seedling breeding of spring rape with high yield and quality. In this study， a gene， named BnFY34， specifically expressed gene under seedling stage， was screened out with cDNA-AFLP， and successfully cloned in full-length 455 bp with RACE， including complete Open Reading Frame （ORF） and coding a protein with 71 amino acid residues. The protein has a molecular weight of 8.04 kD and a theoretical isoelectric point of 10.25. Furthermore， three α-helix and no β folding structures existed in the tertiary structure of protein BnFY34. The BnFY34 gene was compared with the genome sequence of Brassica napus. The results showed that the BnFY34 gene located in the C4 chromosome of B. napus and consisted of three exons and two introns. In addition， the genetic relationship between the gene BnFY34 and homologous genes in other plants showed that the gene BnFY34 was under the same subfamily as the Brassica species， and was similar to that of the untranslated gene XM_013837282.1 reported in B. napus up to 100%， but its function needs to be further studied.

Key words： Brassica napus， development， gene expression， cDNA-AFLP

油菜是十字花科蕓薹屬植物，是我國重要的油料作物之一。青海省是春油菜產(chǎn)區(qū)，主要種植春性甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）和春性白菜型油菜（B. campestris）2種，春油菜種植區(qū)域絕對無霜期短，適合早熟性品種種植，春性甘藍(lán)型油菜雜交種產(chǎn)量高、品質(zhì)好，但生育期長，不能在春性白菜型油菜產(chǎn)區(qū)正常成熟 （Du et al，2010）。因此，選育具有廣適性的春性甘藍(lán)型油菜早熟品種，不僅可擴(kuò)大春油菜產(chǎn)區(qū)油菜種植區(qū)域，而且還可以提高白菜型油菜產(chǎn)區(qū)的油菜產(chǎn)量，為社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益 （Wang et al，2011）。

近年來，分子育種已成為目前國內(nèi)外油菜育種研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一 （湯華等，2006）。轉(zhuǎn)基因育種日趨成熟，且廣泛應(yīng)用于油菜遺傳育種當(dāng)中，大大提高了育種的效率。對油菜早熟性狀進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種，首先必須弄清影響早熟性狀的關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)模式。因此，篩選和分離苗期向蕾期轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因，將有助于探究油菜早熟分子機(jī)理，為油菜熟期改良分子育種工作提供有價(jià)值的基因資源和理論依據(jù) （Luo et al，2014）。

植物發(fā)育受許多特異性基因按一定的時(shí)空順序啟動(dòng)和關(guān)閉表達(dá)所控制。模式植物擬南芥的研究表明，植物開花是在4種途徑 （光周期途徑、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑）內(nèi)源和外源信號同時(shí)誘導(dǎo)下，多個(gè)特異性基因在時(shí)間和空間上順序表達(dá)的結(jié)果 （羅玉秀和羅春燕，2015）。在控制植物成花的五個(gè)途徑中，自主開花途徑的分子機(jī)理尚不清楚。目前，自主途徑相關(guān)的6個(gè)基因FVE、FCA、FPA、FLD、LD和FY在擬南芥中都已被克隆，這些基因可能參與染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾，通過抑制FLC基因的表達(dá)促進(jìn)開花 （張生萍等，2016;Hu et al，2014）。盡管自主途徑在擬南芥中研究的很多，但在油料作物油菜中的研究還處于起步階段。cDNA擴(kuò)增性片段長度多態(tài)性 （cDNA-AFLP）是一種基于RT-PCR和AFLP相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，該技術(shù)已成功用于植物生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，比如植物響應(yīng)非生物脅迫，植物-微生物的相互作用， 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物之間差異表達(dá)基因分析等。本研究以86號油菜 （春性甘藍(lán)型油菜與青藏高原白菜型油菜種間雜交的新品系）為材料，用cDNA-AFLP 技術(shù)分離苗期和蕾期差異表達(dá)片段，篩選和鑒定控制開花時(shí)間的新基因，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對該基因進(jìn)行同源性分析和功能分析，為優(yōu)質(zhì)、早熟油菜分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為春性甘藍(lán)型油菜與青藏高原白菜型油菜種間雜交獲得的86號品系，其表現(xiàn)特早熟，對光周期和春化不敏感，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究中心提供。首先選取籽粒飽滿的種子種植于人工氣候箱中，設(shè)置的培養(yǎng)條件為溫度22/18 ℃（晝/夜），16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為350 μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%;然后分別取其苗期（兩葉一心）和蕾期（現(xiàn)蕾初期）的莖尖嫩葉，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

所用主要試劑及試劑盒：大腸桿菌菌株DH5α，克隆載體pMD18-T、各種內(nèi)切酶、T4連接酶、引物接頭、植物總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒。各試劑盒由TaKaRa公司提供，所用引物由上海生工合成，引物序列見表1。

1.2 總RNA提取和雙鏈cDNA合成

按照試劑盒說明，采用TaKaRa公司的RNAiso?Reagent試劑盒提取苗期和蕾期葉片的總RNA，用DNaseⅠ除去提取的總RNA中殘留的基因組DNA。取苗期和蕾期各5個(gè)單株的總RNA將其等量混合，形成兩個(gè)樣品（苗期和蕾期）。cDNA第1鏈和第2鏈的合成參照T Double-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒方法進(jìn)行。

1.3 BnFY34特異片段的獲得

cDNA-AFLP技術(shù)流程及體系參考Yu et al（2011）中的方法進(jìn)行。 將cDNA雙鏈經(jīng)PstⅠ/MseⅠ雙酶切后，用T4 連接酶將Pst I和Mse I的接頭與酶切產(chǎn)物相連接;最后將連接產(chǎn)物稀釋5倍后作為模板，先用預(yù)擴(kuò)增引物PO/MC進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序如下： 94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，20 cycles;72 ℃ 5 min;4 ℃保存。然后，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋25 倍后作為選擇性擴(kuò)增的模板，用選擇性引物（P08/MC09）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13 cycles，每循環(huán)降0.7 ℃;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23 cycles; 72 ℃ 5 min;4 ℃保存。

1.4 BnFY34 cDNA全長克隆

用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，然后將差異片段聚丙烯酰胺凝膠條帶切膠回收純化后為模板，用P08/MC09引物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件與選擇性擴(kuò)增反應(yīng)相同。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離并切膠回收純化，回收純化產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和單克隆培養(yǎng)，挑取白斑進(jìn)行菌液驗(yàn)證后送上海生工測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行 Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對，根據(jù)cDNA-AFLP得到的差異片段的測序結(jié)果，分別設(shè)計(jì)1對3′-RACE和5′-RACE特異引物（表1），按TaKaRa公司的3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-RACE Kit獲得cDNA全長序列。PCR反應(yīng)體系為10? μL，PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板2? μL，10×Buffer 1.4? μL，2.5 mol·L-1 dNTPs 1? μL，10 pmol·L-1的上下游引物各0.3? μL，rTaq 0.2? μL，ddH2O 4.8? μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物的回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測序等步驟同上。

1.5 BnFY34序列分析

將獲得的BnFY34基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast （http：//blast.ncbi.nlm.nih.—gov/Blast.cgi）比對，用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html） 尋找開放閱讀框;通過DNAStar 軟件進(jìn)行多重序列比較和氨基酸同源性分析， 利用產(chǎn)生的比對序列用MEGA4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取和雙鏈cDNA合成

提取的總 RNA 經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，28S、18S和5S 條帶清晰，且 28S RNA 的亮度約為 18S RNA 的 2 倍（圖 1）;經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，OD260/OD280的值在 1.9～2.0，說明提取的 RNA 純度較高、完整性較好，沒有基因組DNA殘留，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

合成的雙鏈 cDNA 經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示雙鏈 cDNA 呈現(xiàn)為 300～3 000 bp 的彌散條帶，符合植物雙鏈 cDNA 的特征，可以用于進(jìn)一步的試驗(yàn)分析。

2.2? BnFY34特異片段的獲得

利用P08/MC09組合對86號油菜苗期（兩葉一心）和蕾期（現(xiàn)蕾初期）葉片差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，獲得了1條158 bp的在苗期特異表達(dá)的基因片段，經(jīng)同源性比對，該段序列位于甘藍(lán)型油菜的C4染色體上，該基因序列與甘藍(lán)型油菜中的未知功能基因XM_013837282.1的相似度達(dá)100%，命名為BnFY34。

2.3 BnFY34 cDNA全長克隆

根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的甘藍(lán)型油菜未知基因XM_013837282.1與BnFY34基因序列的保守區(qū)，用Primer 5設(shè)計(jì)RACE引物，用86號甘藍(lán)型油菜苗期葉片cDNA為模板，采用3′和5′RACE技術(shù)擴(kuò)增出了BnFY34基因3′端224 bp的序列和5′端292 bp的序列，兩端序列中間部分重疊。經(jīng)拼接，獲得了BnFY34基因的cDNA全長455 bp（圖2）。

BnFY34基因與甘藍(lán)型油菜基因組（NC_027770.1）序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因由3個(gè)外顯子，兩個(gè)內(nèi)含子組成。第一外顯子最短（28 bp），第三外顯子最長（286 bp）。另外，BnFY34基因在甘藍(lán)型油菜的C2染色體上存在同源區(qū)段。 BnFY34基因包含完整的編碼框（圖2），BnFY34基因的編碼序列全長為216 bp，編碼71個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

2.4 BnFY34序列分析

BnFY34基因序列分析結(jié)果表明，該基因與已公布的甘藍(lán)型油菜未知基因XM_013837282.1（C4）相似度達(dá)100%;與甘藍(lán)型油菜C2染色體上的轉(zhuǎn)錄因子XM_013820332.1和XM_013820333.1的相似度分別為88%和87%;與深山南芥亞種未知功能基因XM_002873342.1相似性為90%。進(jìn)一步分析該基因與其他植物同源基因的親緣關(guān)系，圖3結(jié)果表明，86號甘藍(lán)型油菜BnFY34基因與蕓薹屬屬于同一亞族，與甘藍(lán)型和白菜型油菜親緣關(guān)系最近。

氨基酸序列分析結(jié)果顯示，BnFY34蛋白相對分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)分別為8.04 kD和10.25。通過SignalP4.0預(yù)測結(jié)構(gòu)表明，BnFY34為非分泌蛋白。TMHMM 跨膜預(yù)測結(jié)果表明，BnFY34為非膜蛋白。SWISS-MODEL網(wǎng)上在線預(yù)測了BnFY34的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白含有3個(gè)α螺旋，不含β折疊。

早熟是春性甘藍(lán)型油菜的重要育種目標(biāo)之一。現(xiàn)蕾是其從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的一個(gè)重要標(biāo)志（羅玉秀和羅春燕，2015）。在模式植物擬南芥中，與成花相關(guān)的數(shù)十個(gè)基因被相繼克隆，而同為十字花科的蕓薹屬植物甘藍(lán)型油菜中只有少數(shù)開花相關(guān)基因被克隆，如光周期基因（BnCO），自主開花基因BnFCA、BnFLD等（Luo et al， 2014;張生萍等，2016;Hu et al， 2014）。本研究采用cDNA-AFLP技術(shù)成功篩選出了一個(gè)苗期特異表達(dá)的基因片段，并采用RACE技術(shù)對其進(jìn)行了全長序列克隆，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因在C4染色體上，編碼71個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。該基因的時(shí)空表達(dá)模式以及功能有待進(jìn)一步研究。

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