傣藥“擺埋丁別”生藥學鑒別研究

楊妮娜 徐安順 趙應紅 王元忠

(1.西雙版納傣族自治州傣醫醫院，云南 景洪 666100；2.中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100； 3.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

目前市場上藥材來源比較復雜，偽劣品經常出現；不適宜的生境、栽培、采收、炮制、儲存、生產、包裝、運輸方法等均可導致藥材有效成分變化而影響其臨床療效；傣藥資源地域性明顯，蘊藏量有限，大面積毀林種茶、橡膠、香蕉致使多種野生資源蘊藏量急劇減少，甚至到了瀕危或易危的程度，如傣百解、荷包山桂花、古山龍、蓬萊葛等。鑒于此，積極地開展傣藥生藥學研究，確保基源的真實性、品質的優良性、資源的可持續發展至關重要。

燈臺葉傣名“擺埋丁別”，系夾竹桃科(Apocynaceae)雞骨常山屬糖膠樹(Alstonia scholaris (L.) R. Br.)的干燥葉，能清火解毒、消腫止痛、止咳化痰，用于治療“攏達兒”(腮腺、頜下淋巴結腫痛)、“農桿農暖”(乳房腫痛)、“乃多皇賣唉列特來”(肺熱咳嗽痰多)、“兵洞飛暖”(瘡瘍疔腫)[1]。其主產于云南、廣西、廣東、湖南、海南、福建、臺灣及東南亞各國，生長于海拔1300m以下的丘陵山地疏林中、水溝邊[1,2]，富含生物堿、萜類、黃酮等成分，具有抗炎鎮痛、止咳平喘、抗腫瘤、調節血脂血壓、調節免疫等藥理活性[3-6]。燈臺葉為《云南省中藥材標準》(第七冊)所收載品種，該標準檢驗項目少，缺乏定量和特征性鑒別指標，無法全面評價該藥材質量優劣[7]，故本研究從基源、性狀、顯微特征、光譜特征、薄層鑒別、定量分析等方面對燈臺葉進行生藥學研究，旨在為燈臺葉質量標準提升、完善提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器：TS-12D+生物組織自動脫水機、QP-生物組織切片機、CS-VI型攤片烤片機、BM-VIII生物組織包埋機(孝感市宏業醫用儀器有限公司)，80i Nikon 生物顯微鏡(日本尼康)，UV-2550雙通道紫外-可見分光光度計(日本島津)，Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)，YP-2壓片機(上海山岳科學儀器有限公司)，1260型高效液相色譜儀(美國Agilent)，GZX-9032MBE數字鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，電子分析天平(美國奧豪斯公司)。

1.2 試藥

1.2.1 試劑：組織標本固定液(無錫市江原實業技貿總公司)，TO型生物制片透明劑(廣州市中南化工儀器有限責任公司經銷)，固綠FCF(國藥集團化學試劑有限公司)，番紅花紅T(天新精細化工開發中心)，丁香油(國藥集團化學試劑有限公司)，分析純甲醛溶液(汕頭市達濠精細化學品有限公司)，中性樹膠(中國上海標本模型廠)，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲酸、三氯甲烷、丙酮等分析純試劑(天津風船化學試劑科技有限公司)，分析純溴化鉀(成都化學試劑廠)，色譜級乙腈、甲醇(色譜純美國fisher)。

1.2.2 對照品：燈臺葉對照藥材(中國食品生物制品鑒定研究所)，鴨腳樹葉堿、蘆丁(中國食品藥品鑒定研究院)，熊果酸、齊墩果酸(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2.3 樣品信息：本研究所用樣品采自云南西雙版納，經西雙版納傣族自治州傣醫醫院趙應紅傣藥主任藥師鑒定為夾竹桃科植物糖膠樹的葉子，具體信息見表2。

2 方法與結果

2.1 原植物鑒別：喬木，高7m，直徑28cm。枝輪生，皮孔密集，具白色乳汁，無毛。葉輪生，每輪3～10片，倒披針形或匙形，倒卵狀長圓形、偶見橢圓形或長圓形，長7～28cm，寬2～11cm，革質，無毛，基部楔形，頂端通常圓鈍或微凹，偶見急尖或漸尖；側脈密生而平行，25～50對，近水平橫出至葉緣連接；葉柄長1.0～3.0cm。聚傘花序頂生，被柔毛，總花梗長4～7cm；花梗長約1mm；花冠白色，高腳碟狀，花冠筒長6～10mm，中部以上膨大，內面有柔毛，裂片在花蕾期或裂片基部向左旋轉覆蓋，長圓形或卵狀長圓形，長2～4mm，寬2～3mm；雄蕊長圓形，長約1mm，著生在花冠筒膨大處，內藏；子房2心皮，離生，密被柔毛，花柱絲狀，長4.5mm，柱頭棒狀，頂端2深裂；花盤環狀。蓇葖2，細長，線形，長20～57cm，外果皮近革質，灰白色，直徑2～5mm；種子紅棕色，長圓形，兩端有紅棕色長緣毛，緣毛長1.5～2cm。花期6～11月，果期10月至次年4月[8]。

2.2 性狀鑒別：本品呈倒卵狀長圓形或長圓形，長約12～26cm，寬4～6cm。灰綠色，全緣，上表面色深且具有光澤，下表面顏色較淺無光澤；側脈40～50條，近平行，于邊緣處連接。革質。氣微，味微苦。以葉厚、色灰綠者為佳。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 莖橫切面組織結構：燈臺樹嫩莖橫切片觀可見木栓細胞數列，皮層、形成層、韌皮部散在分布多數草酸鈣方晶和簇晶。中柱鞘有多數成片的纖維群，維管束雙韌型，木質部導管單個徑向。髓部寬廣，細胞呈現類圓形，見圖3。

2.3.2 葉橫切面組織結構：葉橫切面觀可見表皮外有較厚角質層，主脈上下表皮內部均分布有厚角組織。薄壁細胞中含草酸鈣方晶及簇晶。柵欄組織由1～2列細胞構成，延伸至中脈厚角組織處。海綿組織中散在分布較多草酸鈣方晶及簇晶。中脈維管束雙韌型，呈U型或V型排列。木質部導管單個徑向排列。韌皮部可見乳管分布，外方有纖維斷續環繞，周圍細胞中有草酸鈣方晶形成晶鞘[9]，見圖4。

2.3.3 莖粉末特征：本品粉末呈黃綠色。表皮細胞多角形增厚；木薄壁細胞呈長方形，細胞壁有連珠狀增厚；草酸鈣方晶較多，棱角銳尖；偶見石細胞。纖維長梭形，胞腔較大；可見網紋、具緣紋孔及梯形導管。分泌組織中可見黃色物質。

2.3.4 葉粉末特征：本品粉末黃綠色。上表皮細胞呈多角形，垂周壁較平略增厚，可見線狀角質紋理；草酸鈣方晶較多偶見簇晶，直徑25～35μm，棱角銳尖。纖維長梭形，直徑15～45μm，壁不甚厚，胞腔較大，可見晶鞘纖維。導管為網紋、螺紋，直徑5～35μm。木薄壁細胞長方形，長條形，長75～125μm，寬15～45μm，壁呈鏈珠狀增厚，紋孔明顯。乳管內含黃色顆粒狀物。

2.4 薄層鑒別

2.4.1 生物堿類成分薄層鑒別：精密稱取不同批次燈臺葉粉末2 g，加pH=2的鹽酸水40 mL，搖勻，超聲30 min，取出，干燥的玻璃漏斗過濾，濾液用濃氨試液緩慢調至顏色變為淺棕色有絮狀沉淀析出(pH7～8)。用三氯甲烷20 mL萃取，取氯甲烷層，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 ml溶解作為供試品溶液。同法制成對照藥材溶液。精密稱取鴨腳樹葉堿適量，配制成0.5 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》一部附錄)試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷～甲醇(9：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液，供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的橘黃色斑點。結果見圖7。

2.4.2 萜類成分薄層鑒別：精密稱取燈臺葉粉末2g，加石油醚(30-60℃)40mL，振蕩器上慢搖1h，取下，干燥玻璃漏斗過濾，棄去濾液，殘渣揮干溶劑，加甲醇30mL，超聲30 min，搖勻，干燥玻璃漏斗過濾，續濾液做為供試品溶液。同法制成燈臺葉對照藥材溶液。同法制成對照藥材溶液。精密稱取熊果酸對照品適量，配制成0.5 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》一部附錄)試驗，取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇(9：1)為展開劑，展開，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下烘烤15min，取出，供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的紫紅色斑點。見圖8。

2.4.3 黃酮類成分薄層鑒別：取燈臺葉粉末2 g，加甲醇20 mL，超聲提取30 min，干燥玻璃濾器過濾，濾液作為供試品溶液。另去燈臺葉對照藥材粉末2 g，同法制成對照藥材溶液。精密稱取蘆丁對照品適量配制成1 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》四部附錄)試驗，吸取上述三種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以AlCl3溶液，365 nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的黃色斑點。結果見圖9。

2.5 燈臺葉光譜鑒別

2.5.1 紫外可見光譜特征：精密稱取燈臺葉粉末0.0250 g于25 mL具塞試管中，加無水乙醇10 mL，稱定重量，室溫下超聲提取40 min，取出，靜置，再次稱定，無水乙醇補足損失重量，過濾，濾液作為供試品溶液。以無水乙醇為參比液，設定掃描波長235～800 nm，狹縫寬度1.0 nm，采樣間隔0.2 nm，掃描紫外-可見光譜圖，每份樣品平行測定3次，取平均光譜。將原始光譜圖進行扣背景8點平滑處理，以消除基線漂移和光譜噪音干擾。

燈臺葉UV-Vis光譜峰數目較多，涵蓋信息量較大。根據吸收峰位置及變化的幅度可以將光譜分為三段，第一段為235～400 nm，第二段為400～500 nm，第三段為500～800 nm。第一段中吸收峰數目最多，主要集中在270 nm、287 nm和325 nm，可能是醛酮n→π*躍遷產生的R帶或芳香環精細解構B帶在助色團影響下紅移的結果，推測可能與燈臺葉中生物堿和黃酮類成分有關。同時第一段中吸光度及其變化幅度最大，體現出不同月份光譜圖的指紋特征。第二段吸收峰較少主要分布在410 nm和464 nm附近，吸光度及其變化較第一段減小。第三段圖譜中不同樣品吸光度及變化無明顯差異，但在665 nm處均有一個較大吸收峰，可能是葉綠素的吸收峰。

2.5.2 紅外光譜特征：精密稱定樣品0.0020 g和溴化鉀0.1000 g于瑪瑙研缽中，充分研磨混勻后壓片，每批樣品平行三份。溴化鉀壓片置于紅外光譜儀中，設定掃描范圍為4000～400 cm-1，累計掃描次數16，分辨率4 cm-1，掃描后獲取樣品原始紅外光譜。實驗過程中及時扣除CO2和水分的背景干擾。原始圖譜經過自動基線校正、自動平滑、縱坐標歸一化處理。

燈臺葉樣品在3500～2800 cm-1和1800～500 cm-1波段呈現指紋特征。吸收峰主要集中在3345、2925、2855、1733、1622、1318、1248、1069、778 cm-1。3345 cm-1吸收峰強而寬為締合O-H伸縮振動吸收；2925 cm-1和2855 cm-1中等強度吸收峰歸屬為飽和C-H鍵的伸縮振動，即-CH2-的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動吸收峰；1733 cm-1附近中等強度吸收峰為醛羰基藍移的結果，歸屬為酯羰基的伸縮振動吸收；1622 cm-1為C=C伸縮振動；1318 cm-1處弱吸收為O-H鍵的面內彎曲振動；1248 cm-1處中等強度吸收峰為C-O鍵的伸縮振動；1069 cm-1處較強吸收為C-O-C(醚鍵)伸縮振動；778 cm-1附近弱吸收歸屬為=C-H的面外彎曲振動。

2.6 含量測定

2.6.1 線性關系考察：精密稱取鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸對照品各16.1 mg、10 mg、12 mg，于10 mL容量瓶中，加色譜級甲醇溶解后定容到刻度，配制成濃度為1.61 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1的對照品溶液。分別精密吸取鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸對照品溶液，加甲醇稀釋至不同濃度，制成單標溶液，由低至高依次進樣，以濃度(mg·mL-1)為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，得回歸方程、相關系數(R2)、檢測限(LOD，S/N=3)、定量限(LOQ，S/N=10)。

表1 鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸線性關系考察結果

2.6.2 精密度、重復性、穩定性考察：取同一批次樣品制備供試溶液，連續進樣6次，計算每個成分6次峰面積的相對標準偏差，鴨腳樹葉堿RSD為0.08%，熊果酸RSD為0.13%，齊墩果酸RSD為0.16%，結果表明儀器精密度良好。平行稱取同一樣品6份，制備供試溶液后測定，以每個成分6次峰面積RSD為參考，鴨腳葉堿0.29%，熊果酸0.64%，齊墩果酸0.53%，表明方法重復性較好。取同一批次樣品，分別制備供試品溶液放置0，2，4，6，8，12，24，48 h后測定，每個成分8次進樣峰面積RSD在0.29%-1.82%，表明樣品供試液在48 h內穩定。

2.6.3 鴨腳樹葉堿含量測定：分別取各批次樣品1 g，精密稱定，置潔凈試管中，加pH=2的鹽酸水溶液20 mL，超聲提取30 min，取出，干燥玻璃漏斗過濾，濾液用氨水調至pH=8，轉移至干燥的分液漏斗中，三氯甲烷萃取兩次，每次20 mL，合并三氯甲烷層，水浴揮干，殘渣加色譜級甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶。采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(250×4.6 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%氨水(40：60)為流動相，流速1.0 mL·min-1，分別設置柱溫30 ℃，檢測波長287 nm，進樣量10 μL。

2.6.4 熊果酸、齊墩果酸含量測定：精密稱定樣品0.1 g于潔凈具塞試管中，加入甲醇2 mL，混勻，超聲提取30 min，取出，提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液備用。Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(250×4.6 mm, 5 μm)，流動相為甲醇-0.1%甲酸水(88：12)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

表2 不同批次樣品中鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸含量測定結果(mg·g-1)

3 結論

燈臺葉原植物形態、藥材形狀、不同器官顯微組織結構特征明顯；薄層色譜分離度較好且斑點清晰；紫外可見光譜、傅里葉紅外光譜吸收峰和光譜特征明顯；建立的鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸含量測定方法精密度、穩定性和重復性良好，為該藥材的質量控制與資源評價提供了堅實的科學基礎。

[1]林艷芳, 依專, 趙應紅. 中國傣醫藥彩色圖譜[M]. 云南民族出版社, 2003： 303-304.

[2]胡宗達, 吳兆錄, 閆海忠, 等. 滇西南燈臺樹種植適宜區規劃研究[J]. 云南大學學報(自然科學版), 2005, 27(1)： 86-92.

[3]Wang CM, Chen HT, Wu ZY, et al. Antibacterial and Synergistic Activity of Pentacyclic Triterpenoids Isolated from Alstonia scholaris[J]. Molecules, 2016, 21： 139.

[4]Kandhare AD, Patil MV, Bodhankar SL. Ameliorative Effect of Alkaloidal Fraction of Leaves of Alstonia scholaris Against Acetic Acid Induced Colitis via Modulation of Oxido～nitrosative and Pro～inflammatory Cytokines[J]. Pharmacologia, 2016, 7： 170-181.

[5]Arulmozhi S, Mazumder PM, Lohidasan S, et al. Antidiabetic and antihyperlipidemic activity of leaves of Alstonia scholaris Linn. R. Br.[J]. Eur J Integr Med, 2010, 2： 23-32.

[6]Ragasa CY, Lim KF, Shen CC, et al. Hypoglycemic potential of triterpenes from Alstonia scholaris[J]. Pharm Chem J, 2015, 49： 30-33.

[7]云南省食品藥品監督管理局. 云南省中藥材標準第七冊[S]. 云南出版集團云南科技出版社, 2005.

[8]中科院植物志編委會. 中國植物志[M]. 科學出版社, 1977： 90.

[9]Khyade MS, Vaikos NP. Pharmacognostical studies on the Leaves of Alstonia scholaris R. Br.[J]. Journal of Pharmacy Research, 2009, 2(5)： 858-861.