17α-甲基睪酮對棘胸蛙生長發育及性別分化的影響*

劉志芳， 嚴 紅， 鄭榮泉，3， 張啟鵬， 梅祎蕓，王志剛， 洪 燕， 周婷婷

(1.浙江師范大學 野生動物保護與利用技術中心,浙江 金華 321004；2.浙江師范大學 野生動物生物技術與保護利用浙江省重點實驗室，浙江 金華 321004；3.浙江師范大學 行知學院，浙江 金華 321004)

環境雄激素主要包括天然雄激素與合成雄激素.天然雄激素包括睪酮(testosterone)及其衍生物雄酮(androsterone)、雄烯二酮(androstenedione)等.天然與合成雄激素類物質是一類典型的內分泌干擾物[1-2].環境雄激素可干擾水生生物正常的內分泌系統，引起雄性比例偏高、雌性出現雄性第二性征、卵精巢和卵黃蛋白原的誘導受抑制、生殖能力下降等[3-5]，也可引起哺乳動物出現雄性化特征[6-8].17α-甲基睪酮(17α-methyltestosteron，MT)，又名甲基睪丸素或甲基睪丸酮，是一種人工合成的雄性激素，能促進雄性性器官發育成熟和第二性征的形成和維持.實驗已經證實，不同濃度的 MT 對不同魚類有不同的生物學效應[9].低濃度 MT 可促進魚類生長，然而高濃度 MT 則導致魚類的畸形和死亡[10].對該化合物內分泌干擾效應的研究結果還顯示，MT 能改變魚類的性別，導致雌魚雄性化[11].在MT 對食蚊魚(Gambusiaaffinis)形態雄性的研究中顯示，MT 的雄激素效應明顯，可導致雌魚在生長發育過程中出現形態雄性化[12].對于已分化的性腺，外源激素可改變魚類個體的副性征、性行為及導致敗育或不育[13].在較低等的生物中，外源激素還可以引起性腺的再分化[14]，進而改變個體的性別[15-16].

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)是我國特有的兩棲動物，俗稱石蛙、石雞，分布于我國長江以南地區的山澗溪流中[17].棘胸蛙藥食兩用，據《本草綱目》[18]記載,石蛙具有較高的藥用價值，可以作為醫用輔助中藥，具有強身健體、降血壓、清解熱毒、降血脂等功效，素有“百蛙之王”的美名.棘胸蛙的養殖規模隨著市場需求逐步擴大，棘胸蛙對養殖條件、生活環境等要求較高，同時也受到種源及技術等限制，近年內難以形成一定的生產規模[19].棘胸蛙存在兩性異形，雄體大于雌體[20].因而棘胸蛙的高效養殖模式及單性養殖技術在棘胸蛙生產中顯得尤為重要.本試驗用不同劑量MT飼料飼喂棘胸蛙小蝌蚪，通過組織學方法觀察性腺變化，探討外源雄性激素對棘胸蛙生長發育及性腺的影響，為棘胸蛙的單性養殖及規?；a提供理論及技術基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

棘胸蛙來自浙江金華綠谷清泉生態石蛙養殖場和建德市鑫泉金石蛙生態養殖場.在棘胸蛙的繁殖季節(2014，2015年的4—9月)，將不同親本同一天產出的受精卵混合放到孵化箱中流水自然孵化，密度為1 000 卵粒/m3水體，培養溫度控制自然水溫(22～24 ℃)，觀察胚胎發育，蝌蚪孵出后帶回實驗室中進行實驗.

1.2 實驗試劑

17α-甲基睪酮購于山東西亞化學工業有限公司，純度98%.

1.3 實驗方法

采用乙醇噴霧法將MT溶解于95%乙醇，之后將溶有MT的酒精和在牛蛙蝌蚪飼料里，再將飼料放入40 ℃烘箱中烘干后投喂.設置10，30，50 mg/kg實驗組和0 mg/kg對照組，對照組用不含MT的相同體積的95%乙醇來處理.每組隨機分得同一批次剛孵出蝌蚪100尾；蝌蚪每天定時定點投喂1次處理過的高蛋白牛蛙蝌蚪飼料，投喂量為蝌蚪體重的3%～5%，同時每隔5 d投喂1次植物性餌料(蒸熟的苦麻葉)，以增強蝌蚪的抵抗力，投飼相應餌料至蝌蚪變態為止；實驗期間，用吸水泵清除水槽底部的糞便和剩余飼料，每次吸出一半培養用水，再補充等量經過充分曝氣的自來水，水溫控制在22～24 ℃.實驗期間每組水體中放入增氧泵時刻增氧，并用凈水器形成循環流水，在養殖箱中放置1～2片瓦片遮陰，形成山澗流水環境來提高蝌蚪的生長條件.

在飼養60 d時，各濃度組蝌蚪都無變態，此時測量各濃度組蝌蚪的體長體重，記錄實驗數據.自第1只蝌蚪開始變態后，每天定時記錄每組蝌蚪的變態情況.同時在實驗期間，記錄每組蝌蚪的死亡、變態畸形等.

1.4 組織學分析

發育85 d的蝌蚪統計完實驗數據后，切去蝌蚪尾巴及透明口部，將軀干固定于FAA液中固定3～4 h，做常規石蠟切片，經HE染色在生物顯微鏡下觀察照相.

1.5 數據處理和統計分析

2 結果與分析

2.1 MT對蝌蚪體重體長的影響

各濃度組棘胸蛙蝌蚪飼喂60 d后都沒有變態的情況，但是體長生長速度呈現出與劑量相關的減少趨勢.最高濃度組(50 mg/kg)體長與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，其他濃度組體長與對照組相比也顯著減少(P<0.05)(見表1).表明MT對棘胸蛙蝌蚪的體長有一定的抑制作用.體重同樣呈現出與劑量相關增長率的減少趨勢(見表1)，但差異不顯著(P>0.05).

表1 MT對棘胸蛙蝌蚪體重體長的影響

注：同列數據后大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01).

2.2 MT飼喂對蝌蚪發育時間的影響

與對照組相比，10,30 mg/kg處理組蝌蚪變態周期均沒有顯著變化(P>0.05)，只有50 mg/kg組蝌蚪變態周期顯著縮短(P<0.01)(見表2).表明高濃度MT激素效應明顯，能加快蝌蚪的變態發育.

表2 MT對棘胸蛙蝌蚪發育時間的影響

注：同列數據后小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；同列數據后大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01).

2.3 MT飼喂對蝌蚪成活率、變態率、畸形率的影響

統計各組棘胸蛙蝌蚪的成活率、變態率、畸形率(見表3).與對照組相比，各實驗組蝌蚪的成活率顯著降低(P<0.01)，說明MT對棘胸蛙蝌蚪有致死效應；MT對棘胸蛙蝌蚪的畸形率影響較大，各實驗組與對照組間存在極顯著性差異(P<0.01)，畸形表現為蝌蚪變態不完全，前肢殘缺或長不出前肢，跳躍有障礙，變態成幼蛙后易死亡.與對照組相比，各濃度組對蝌蚪變態率沒有引起顯著差異(P>0.05).表明棘胸蛙蝌蚪的變態率不受MT影響.

表3 MT對棘胸蛙蝌蚪的成活率、變態率及畸形率的影響

2.4 MT飼喂對蝌蚪雌雄比例的影響

對同一變態時期蝌蚪的性腺進行切片觀察，統計性腺切片發現，雄性率與MT濃度呈正相關趨勢.為獲得最佳觀察視野和觀察效果，對性腺切片放大不同倍數進行觀察發現，除了正常性腺(見圖1)之外每個實驗組均出現中間形態性腺，表現為一邊精巢一邊卵巢或一個性腺上既有精原細胞又有卵原細胞(見圖2).10 mg/kg MT含量實驗組雄性率為52.8%，切片有2只中間形態的性腺；30 mg/kg MT含量實驗組，雄性率為62.0%，切片有4 只中間形態的性腺；其中最高濃度組雄性率達66.0%，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，切片有5 只中間形態的性腺(見表4).其中圖中字母分別表示:Ac：腹腔；Da：背主動脈；G：消化道；M：中腎；Md：中腎管；Mu：肌肉；O：卵巢；Oo：卵原細胞；PGC：原生殖細胞； Sp：脊柱；Sc：次生性腔；Sg：精原細胞；T：精巢；Vi：內臟.

表4 MT對棘胸蛙性比的影響

(a)0 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大25倍的正常發育卵巢；(b)50 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大100倍的正常發育卵巢；(c)10 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大25倍的正常發育精巢；(d)0 mg/kg MT組完成變態幼蛙性腺橫切面，示放大100倍的正常發育精巢

圖1 蝌蚪正常性腺切片

(a)50 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大50倍一側性腺為精巢；另一側仍含有卵原細胞的精巢;(b)30 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大200倍含有卵原細胞的精巢，性腔未消失

3 討 論

3.1 MT對棘胸蛙生長發育的影響

激素誘導一直是激發經濟動物生長潛能的重要方式.在魚類，激素存在抑制或促進生長兩種情況.據報道，睪酮能夠促進雌性日本粗皮蛙卵巢向著精巢大小方向發展[21].本研究采用不同濃度MT飼喂棘胸蛙蝌蚪，導致蝌蚪體長呈現與劑量相關的負增長關系，體重沒有表現出明顯的差異.實驗期間，高濃度組蝌蚪生長速度加快，變態周期縮短，提前進入變態期.表明高濃度MT能夠抑制蝌蚪的生長速度，體重、體長的減小所釋放的能量可能用于蝌蚪的快速生長，使其快速完成變態.

對魚類激素誘導性別轉化的研究顯示，性別逆轉的動物其存活率普遍較低[22]，表明遺傳型與表現型不相同的物種很容易死亡.激素處理強度表現為激素的使用劑量和持續處理時間2個方面及二者的交互作用.激素誘導作用具有閾值，作用效果在閾值以內時，沒有顯著影響力，當激素處理強度超過這個閾值后就會導致魚類的成活率明顯降低[23].到目前為止，尚未有報道性激素處理導致成活率升高的現象.本實驗研究表明，MT可降低棘胸蛙蝌蚪的成活率，但各處理組的成活率的差異性不顯著，可能是MT濃度或處理時間沒有達到致死率最高的閾值.本實驗中各實驗組與對照組相比，畸形率顯著增高.由于畸形的幼蛙不具備跳躍捕食的能力，一般都會在完全變態后幾天內死亡，造成死亡率升高的原因與MT影響下畸形率升高有一定聯系.

3.2 MT對棘胸蛙性腺分化的影響

已有研究表明，外源激素MT除了可以促進正常的性腺分化外，還可使性腺出現畸形，如精巢中出現卵巢腔、性腺導管發育不全或消失、卵巢與精巢組織出現在同一個體中(兼性魚)、性腺萎縮和生殖細胞退化或消失(不育魚)、性腺發育抑制等[24].有研究報道，不同含量MT對黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)雄性率影響不大，但每個含量組都有雙性魚的出現[25].在本實驗中，MT也導致蝌蚪中有中間性腺的現象，同一蝌蚪中既有精巢又有卵巢，在10，30和50 mg/kg組，中間態個體均有出現.中間態的蝌蚪的性腺可能正處于逆轉時期.MT 已被認為是一種有效的性腺轉化誘導劑，魚類在自然性逆轉發生之前的任何年齡階段用其處理均可誘導轉雄[26-27].本研究顯示，當濃度達到50 mg/kg時，其雄性率顯著升高，而低濃度MT組雄性率無顯著變化.表明高濃度MT可誘導棘胸蛙雄性化.

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