沉默lncRNA PVT1對鼻咽癌細(xì)胞C666-1增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響

萬仁強(qiáng) 林勇 肖平 龔平桂

1廣東省第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（廣州510317）；2喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（新疆喀什844000）

長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個(gè)核苷酸，不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。研究表明lncRNA與基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝等有著密切的聯(lián)系，因此被稱為基因組學(xué)的富礦。近年來大量研究［1-2］表明lncRNA在多種疾病中扮演了重要的角色，并且作為調(diào)節(jié)因子通過多種途徑參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、藥物抵抗、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等［3-6］。

變異性漿細(xì)胞瘤異位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）是最近被發(fā)現(xiàn)的一種特異性的lncRNA，全長1 716 bp，位于人類染色體8q24，原癌基因MYC下游，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物屬于基因間的lncRNA［7］。近年來研究［8-11］表明，PVT1 在多種腫瘤中高表達(dá)，例如肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等，并且與預(yù)后相關(guān)。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于PVT1在鼻咽癌中的研究還比較少，因此本研究通過檢測PVT1在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)，利用siRNA干擾技術(shù)研究降低PVT1后對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響，為進(jìn)一步研究PVT1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株鼻咽癌細(xì)胞5-8F、C666-1、CNE-1、6-10B、CNE-2、HNE-1、HONE-1及鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑RNA提取試劑盒Rneasy MiNi Kit購自美國Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒iScript cDNA synthesis kit購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM購自TakaRa公司；Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；噻唑藍(lán)（MTT）購自上海碧云天公司；Traswell小室、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69接種于含10%胎牛血清的新鮮Keratinocyte-SFM中培養(yǎng)。人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、C666-1、CNE-1、6-10B、CNE-2、HNE-1及HONE-1接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基加青霉素與鏈霉素，兩抗生素最終濃度分別為100 U/L及100 mg/L，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測PVT1的表達(dá)按照RNA提取試劑盒提取鼻咽癌細(xì)胞及NP69細(xì)胞中總RNA，測定濃度，-80℃保存。采用SYBR Green法檢測PVT1的相對表達(dá)，反應(yīng)條件：95℃15 min，95℃30 s，60℃60 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。siPVT1 F：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3′；R：5′-UAGCAGCAACGGAGAAGCTT-3′；siNC F：5′-UUCUCCGAACGUGUGUCACGUTT-3′；R：ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；PVT1 上游引物5′-GTCTTGGTGCTCTGTGTTC-3′，下游引物5′-CCCGTTATTCTGTCCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物 5′-GCTGATGATCTYGAGGCTGTGTTGTC-3′。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及RT-PCR檢測運(yùn)用LipfectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染siPVT1及對照siRNA，分別于24及48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測PVT1的表達(dá)。PVT1干擾RNA（siPVT1）及陰性對照（siNC）序列由吉瑪公司合成提供；siPVT1上游序列：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCATT-3′，下游序列：5′-UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3′；siNC上游序列：5′-GCUACGAUCUGCCCAAGAUTT-3′，下游序列：5′-AUCUUAGGCAFGAUCGUCGCTT-3′。

1.2.4 MTT比色實(shí)驗(yàn)將對數(shù)期生長的siPVT1/C666-1細(xì)胞按1×103個(gè)/孔接種至96孔板內(nèi)，重復(fù)5孔。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后，加入150 μL DMSO溶解，酶標(biāo)儀570 nm處檢測各孔OD值，取平均值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5 Transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并用無血清培養(yǎng)基漂洗3遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)。在Boyden小室上室加入（或不加）200 μL稀釋的Matrigel膠，過夜干燥。在Transwell小室上室接種1× 105個(gè)細(xì)胞（200 μL），在小室的下室加入300 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS浸泡洗滌2次。95%乙醇浸泡固定Transwell上室穿膜細(xì)胞，PBS洗滌2次，以新鮮配制的蘇木素染液，浸染3～5 min，然后用棉簽擦除上室中未通過濾膜的細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測EMT標(biāo)記物的表達(dá)轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、β-actin抗體1∶2 000稀釋）4℃過夜孵育，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗（抗兔1∶3 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，暗室加入ECL發(fā)光液后曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PVT1在人鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR檢測PVT1在鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2、5-8F、C666-1、HNE-1、6-10B及HONE-1中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與NP69細(xì)胞相比，PVT1在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染siPVT1后PVT1的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，C666-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPVT1后PVT1的相對表達(dá)量顯著降低，見圖2。

2.3 細(xì)胞增殖率檢測MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siPVT1 24 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為（0.34±0.05），對照組細(xì)胞的OD值為（0.59±0.06），經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染48、72 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值分別為（0.53± 0.04）、（1.15± 0.12），對照組細(xì)胞的OD值為（0.90±0.09）、（1.67±0.13），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖1 PVT1在人鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of PVT1 in human nasopharyngeal carcinoma cells

圖2 轉(zhuǎn)染siPVT1后C666-1細(xì)胞中PVT1的表達(dá)Fig.2 Expression of PVT1 in C666-1 cells after transfection of siPVT1

圖3 siPVT1能抑制鼻咽癌細(xì)胞生長Fig.3 SiPVT1 can inhibit the growth of nasopharyngeal carcinoma cells

2.4 下調(diào)PVT1對C666-1遷移、侵襲能力的影響Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示（圖4A），siPVT1組細(xì)胞穿膜數(shù)為（54±6.3）個(gè)，siNC組的細(xì)胞穿膜數(shù)為（110±8.9）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。侵襲實(shí)驗(yàn)（圖4B）結(jié)果示：siPVT1組細(xì)胞穿膜數(shù)為（41±5.8）個(gè)，siNC組的細(xì)胞穿膜數(shù)為（72±7.3）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明下調(diào)PVT1后可抑制鼻咽癌細(xì)胞C666-1的遷移及侵襲。

2.5 下調(diào)PVT1對鼻咽癌細(xì)胞EMT的影響熒光定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，下調(diào)PVT1可升高鼻咽癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)，降低N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，見圖5。

3 討論

鼻咽癌是我國南方及東南亞地區(qū)常見的一種惡性腫瘤，其分布具有明顯的地域性和種族性。放療是治療鼻咽癌的主要方法，目前放療同步化療是鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法［12］。然而經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)治療后仍有約20%～30%鼻咽癌患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［13］。出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后缺乏有效的治療手段，這也是造成鼻咽癌患者死亡的最主要原因。因此，尋找鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵分子作為有效的治療靶點(diǎn)，對于治療及預(yù)防鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、延長患者的生存期和提高生存質(zhì)量具有非常重要的意義。

lncRNA PVT1位于原癌基因MYC下游，已被證明與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，具有癌基因的作用；有報(bào)道稱，MYC與PVT1一同擴(kuò)增，形成“伙伴”關(guān)系，PVT1可幫助增強(qiáng)MYC蛋白的致癌作用［7］；另一研究［14］表明，在乳腺癌中PVT1和MYC可協(xié)同作用調(diào)控RSPO1的表達(dá)，增加乳腺癌癌變前的特性，促進(jìn)癌癥形成。高表達(dá)的PVT1與前列腺癌的級別相關(guān)，并且導(dǎo)致前列腺癌的激素抵抗［15］，降低PVT1的表達(dá)可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等［16-17］。

本研究首先利用熒光定量RT-PCR檢測鼻咽癌細(xì)胞中PVT1的表達(dá)，檢測結(jié)果顯示5-8F、C666-1、CNE-1、6-10B、CNE-2、HNE-1及HONE-1等多種人鼻咽癌細(xì)胞中PVT1的表達(dá)均較對照組增高，但瘤細(xì)胞各組間也有一定的差異，考慮可能跟不同的鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性有關(guān)，如生長增殖及遷徙等能力，另外，不同組細(xì)胞經(jīng)過多次不同傳代培養(yǎng)后生物學(xué)特性發(fā)生改變，從而造成不同組人鼻咽癌細(xì)胞中PVT1的表達(dá)存在差異；然后，利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)合成PVT1-siRNA，將此siRNA序列與對照siRNA轉(zhuǎn)染C666-1細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測沉默效果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24及48 h后，PVT1表達(dá)顯著下降。采用MTT法檢測沉默PVT1對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，沉默PVT1可顯著抑制C666-1細(xì)胞增殖。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，沉默PVT1后C666-1細(xì)胞的透膜細(xì)胞數(shù)少于陰性對照組，證實(shí)PVT1具有促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移及侵襲的能力。

圖4 Transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)Fig.4 Transwell cell migration and invasion experiment

圖5 下調(diào)PVT1逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞EMTFig.5 Down regulation of PVT1 to reverse nasopharyngeal carcinoma cell EMT

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）現(xiàn)象與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在此過程中上皮細(xì)胞的極性喪失，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)接觸減少，遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)上皮表型丟失而逐漸獲得間質(zhì)表型。EMT的特征性改變?yōu)槠渖掀?biāo)志物表達(dá)量下降（如E鈣黏素、角絲蛋白），而間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)量升高（如N鈣黏素、波形蛋白等），同時(shí)EMT轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子表達(dá)量也增加（如snail）。為研究沉默PVT1是否能抑制EMT，本研究檢測了E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，結(jié)果顯示，下調(diào)PVT1可升高鼻咽癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)，降低N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，提示下調(diào)PVT1表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞EMT有逆轉(zhuǎn)作用，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［17-18］。

綜上所述，PVT1在鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，提示PVT1有可能是與鼻咽癌形成和進(jìn)展相關(guān)的一個(gè)重要基因，本研究的完成為鼻咽癌的治療提供了一個(gè)新的潛在的治療靶點(diǎn)。

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