骨髓特異性高表達neuritin轉基因小鼠的構建

劉遠志 周吉銀 張祚 李和教 黃毅嵐

1西南醫科大學藥學院（四川瀘州 646000）；2陸軍軍醫大學第二附屬醫院國家藥物臨床試驗機構（重慶 400037）；3西南醫科大學附屬醫院藥學部（四川瀘州 646000）

Neuritin（又名：Nrn1或CPG15）是在研究可塑性相關基因時被發現的一種神經營養因子，具有促進軸突、樹突生長和皮層神經細胞的存活、抑制神經細胞凋亡、調節神經細胞回路形成等作用，對受損神經有著明顯修復的功效［1-2］。目前，隨著糖尿病的病患率急劇上升，在糖尿病診斷5年后其外周神經病變的發病率大于50%；且在糖尿病周圍神經病變后期，患者會發生糖尿病足等嚴重并發癥。研究表明當糖尿病發生后，骨髓神經受損情況對糖尿病周圍神經病變密切相關，但是具體作用機制尚不十分清楚，需進一步研究［3］。因此，建立骨髓特異性高表達neuritin小鼠模型，可作為研究neuritin對骨髓神經損傷修復作用的良好平臺，將為進一步研究骨髓神經病變與糖尿病周圍神經病變提供基礎。本研究使用CMV-Loxp-STOPLoxp系統高表達neuritin轉基因小鼠和骨髓特異性Lyz2-Cre轉基因小鼠進行繁殖、交配，篩選出骨髓特異性高表達neuritin的轉基因小鼠作為動物模型，并對模型鼠進行骨髓鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗動物委托廣州賽業生物科技有限公司構建CMV-loxp-stop-loxp系統高表達neuritin（loxpstop-loxp-neuritin）轉基因小鼠，骨髓特異性Lyz2-Cre小鼠購至美國杰克遜實驗室。小鼠在陸軍軍醫大學第二附屬醫院SPF級動物室飼養和繁殖。

1.2 主要器材與試劑器材：PCR擴增儀（美國Bio-Rad）；DYCP-31D型電泳槽（北京六一儀器廠）；恒溫金屬浴（杭州博日公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad CFX96 Touch）；小型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；雙光速微量核酸蛋白測定儀（美國Thermo公司）；凝膠成像分析系統（美國BIO-RAD公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）。試劑：PCR引物（北京擎科生物技術有限公司），序列均由美國Jackson實驗室提供；蛋白酶K（美國Sigma公司）；2×Taq Mix（北京天根公司）；DNAmarker（上海生工生物技術工程有限公司）；瓊脂糖（Invitrogen公司）；溴化乙錠（EB）（美國Sigma公司）；鼠抗Nueritun單抗（Santa Cruz公司）；Alexa Fluor?647羊抗鼠二抗（碧云天公司）；封閉用正常山羊血（武漢博士德生物技術有限公司）；TritonX-100（上海生工生物技術工程有限公司）。其他常用試劑均屬于國產或進口的分析純試劑。

1.3 小鼠的飼養和繁殖采用CMV-loxp-stop-loxp系統得到的全身高表達neuritin（Loxp基因）轉基因小鼠（F0），與骨髓特異性Lyz-cre小鼠進行雜交，獲取表達兩種基因型（Loxp基因、Lyz-Cre基因）的陽性小鼠（F1），即骨髓特異性高表達neuritin的轉基因小鼠。

1.4 小鼠的基因型鑒定

1.4.1 小鼠DNA的提取用酒精擦拭待測小鼠鼠尾后，剪取尾尖約0.5～1 cm的組織，置于1.5 mL的Eppendorf（EP）管中，操作參照DNA提取試劑盒（北京天根生物），進行基因組DNA的提取，以雙光速微量核酸蛋白測定儀測定濃度后，置于-20℃保存。

1.4.2 Neuritin基因的鑒定使用neuritin引物擴增鼠尾基因組DNA，鑒定其是否含有loxp位點。Loxp 位點引物：Loxp-F：5′-TCCCCATCAAGCTGATCCGG-3′，Loxp-R：5′-TCACACTTGCCC-GCTGCTCT-3′；Actin 內參引物：Actin-F：5′-ACTCCAAGGCACT-TATCACCAT-3′，Actin-R：5′-AT-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′。PCR 條件：（1）94 ℃預變性3 min，（2）94℃變性30 s，（3）62℃退火35 s，（4）72 ℃延伸35 s，（5）94 ℃變性30 s，（6）60 ℃退火35 s，（7）72 ℃延伸35 s，（8）最后72℃延伸3 min；（2）～（4）重復10個循環（每個循環退火溫度降低0.5℃），（5）～（7）重復25個循環。以1.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，含有loxp位點的neuritin基因擴增產物具有234 bp陽性條帶和413 bp內參條帶，而野生型neuritin基因擴增產物只含有413 bp內參條帶。

1.4.3 Lyz-cre重組酶轉基因的鑒定使用Lyz-cre重組酶基因擴增鼠尾基因組DNA，鑒定其是否含有Lyz-cre重組酶基因。Lyz-cre引物：Lyz-Cre-Mutant：5′-CCCAGAAATGC-CAGA-TTACG-3′，Lyz-Cre-Common：5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′，Lyz-Cre-Wild type：5′-TTACA-GTCGGCCAGGCTGAC-3′。PCR 條件：（1）94 ℃預變性3 min，（2）94 ℃變性30 s，（3）65 ℃退火15 s，（4）68 ℃延伸10 s，（5）94 ℃變性15 s，（6）60 ℃退火 15 s，（7）72 ℃延伸10 s，（8）最后72 ℃延伸2 min；（2）～（4）重復10個循環（每個循環退火溫度降低0.5℃），（5）～（7）重復25個循環。以1.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，含有Lyz-Cre基因擴增產物的雜合子具有700 bp、350 bp陽性條帶，而野生型突變基因小鼠只含有350 bp條帶。

1.4.4 組織免疫熒光檢測小鼠骨髓neuritin的表達（1）取組織：用4%的多聚甲醛對實驗小鼠進行灌注固定，分離股骨；（2）組織固定與脫鈣：將取得的股骨用4%的多聚甲醛淹沒放于4℃冰箱固定過夜，于第二日將股骨取出放于10%EDTA脫鈣1周；（3）組織切片：首先在樣品托上涂一層OCT包埋膠，將脫鈣后的股骨置于其上，4℃冰箱預冷5～10 min讓OCT膠浸透組織，然后在其上再添一層OCT膠，置于速凍架上30 min；修片，切片：股骨切片厚度8 μm，切片室溫放置晾干后，用0.01 mol/L PBS液浸泡3遍，每遍5 min；（4）封閉：將切片放于封閉液（含0.3%Triton X-100和5%BSA）中孵育30 min；（5）孵育一抗：傾去血清，加入一抗：鼠抗Nueritun單抗1∶100，4℃孵育過夜；陰性對照用PBS代替；（6）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（7）Alexa Fluor?647（1∶400）二抗，37 ℃避光孵育1 h；（8）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（9）復染核：滴加DAPI，避光孵育13 min；（10）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（11）用吸水紙吸干多余的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片并在熒光顯微鏡下拍照。

1.5 統計學方法實驗結果用SPSS 17.0軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，兩用獨立樣本的t檢驗；多組組間對比采用Two-way ANOVA（雙尾方差分析），以P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠繁殖情況親代loxp-stop-loxp-neuritin與轉基因小鼠lyz-Cre/+交配，產生的F1代小鼠經PCR鑒定共有4種基因型，即neuritinloxp/+_lyz-Cre/+、neuritinloxp/-_lyz-Cre/+、neuritinloxp/+_lyz-Cre/-、neuritinloxp/-_lyz-Cre/-；各占約 25%。neuritinloxp/+_lyz-Cre/+即為骨髓特異性高表達neuritin小鼠。以上繁殖結果遵循孟德爾遺傳定律。

2.2 小鼠基因鑒定親代loxp-stop-loxp-neuritin與lyz-Cre/+雜交后產生的F1代通過2組特異性引物對其DNA進行鑒定，PCR鑒定F1代小鼠基因型的部分結果如圖1。編號6、8、9、10、12小鼠經loxp引物擴增后表現出2條413 bp和234 bp擴增條帶，為 neuritinloxp/+；編號 7、11、13小鼠表現出 1條234 bp擴增條帶，為neuritinloxp/-；編號 7、8、9、11小鼠經Cre引物擴增后表現出2條700 bp和350 bp的擴增條帶，為Lyz-Cre/+，編號6、10、12、13小鼠表現出1條350 bp擴增條帶，為Lyz-Cre/-。結果顯示13號小鼠的基因型為neuritinloxp/-_lyz-Cre/-，為野生型小鼠；6、10、12號小鼠的基因型為neuritinloxp/+_lyz-Cre/-，為雜合子小鼠；7、11號小鼠的基因型為neuritinloxp/-_lyz-Cre/+，為雜合子小鼠；8、9號小鼠的基因型為neuritinloxp/+_lyz-Cre/+，即為骨髓特異性高表達neuritin小鼠（圖1）。

圖1 基因型鑒定PCR產物電泳圖Fig.1 PCR genotyping results of the genotype of transgenic mice

2.3 組織免疫熒光檢測neuritin的表達量共聚焦顯微鏡觀察8周齡neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠與野生型小鼠骨髓neuritin表達量，進一步驗證neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓中是否高表達neuritin。結果如圖2所示，通過Image J 1.50軟件分析，與野生型小鼠相比，neuritin-loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓的neuritin表達量明顯增加（P＜0.05），結果證實PCR方法鑒定neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠可靠（圖3）。

圖2 免疫熒光技術顯示骨髓neuritin的表達Fig.2 Photomicrographs showing the immunofluorescence expression of neuritin in bone marrow

圖3 neuritin在野生型和高表達小鼠骨髓中的表達量比較Fig.3 A comparison of the neuritin expression level of the neuritinloxp/+_lyz-Cre/+mice and the wild type mic mice

3 討論

本研究構建的模型鼠采用的是Loxp-Cre轉基因重組酶系統，其包含Cre重組酶和loxp序列。Cre重組酶能特異性的識別loxp序列，使反向loxp序列間的DNA被顛倒，同向loxp序列間的DNA被切除，實現基因特異性敲除［4］。在骨髓特異性高表達neuritin轉基因小鼠中，于啟動子和靶基因序列之間插入了一段“loxp-stop-loxp”結構，即把構建的“啟動子-loxp-stop-loxp-neuritin”結構導入小鼠中，使小鼠全身細胞均含有neuritin的高表達基因，而此時靶基因的表達處于抑制狀態（此過程由廣州賽業生物科技有限公司完成）［5］。將該鼠與Lyz-Cre酶轉基因小鼠（美國杰克遜實驗室構建）雜交，若其雜交后代的基因型中有既含Lyz-Cre基因又含“啟動子-loxp-stop-loxp-neuritin”的基因，則Lyz-Cre基因會表達骨髓細胞特異性Cre重組酶，催化骨髓細胞loxp間的序列位點進行特異性重組，最終將“stop”轉錄終止結構從基因序列中切除，使小鼠骨髓的neuritin高表達基因得以表達。此外，將不同特性的Cre酶轉基因小鼠與“啟動子-loxp-stop-loxp-靶基因”的轉基因小鼠雜交，可實現靶基因不同部位的表達［6-7］。

因此，為確定小鼠骨髓高表達neuritin蛋白，需驗證雜交后代鼠同時具有Lyz-Cre基因和“啟動子-loxp-stop-loxp-neuritin”基因，本課題組采用DNA的PCR鑒定判斷其基因型。此外，由于轉基因小鼠全身基因組DNA均兼有loxp和Lyz-Cre酶基因，因此對小鼠基因型鑒定時可采用小鼠尾組織DNA提取物［8］。研究結果顯示，兩種轉基因小鼠通過雜交可將各自的基因位點遺傳給后代，且可并存在于一個后代鼠中，獲取我們所需的骨髓特異性高表達neuritin模型鼠（圖1）。同時，利用組織免疫熒光對其骨髓的neuritin蛋白的表達量進行半定量分析，結果表明neuritin-loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓的neuritin蛋白表達量明顯高于野生型小鼠（P＜0.05），差異有統計學意義，證明小鼠模型構建成功。

本研究構建的骨髓特異性高表達neuritin轉基因小鼠，其骨髓會高表達neuritin蛋白，當小鼠骨髓神經受損后，neuritin作為神經營養因子，對受損神經具有顯著的修復作用。骨髓發生神經病變可嚴重影響骨髓中干細胞的功能，如造血干細胞和間充質干細胞［9-10］。造血干細胞主要源于是各種血細胞與免疫細胞的初始細胞，統領著全身造血功能；間充質干細胞是骨髓中的一種具有多向分化潛能的干細胞，具有強大的分化性和自我更新能力，能歸巢到損傷組織發揮修復作用［11-12］。而骨髓神經病變后，神經末梢的數量會急劇減少，骨髓交感神經通過骨髓細胞上β-腎上腺素能受體調控造血干細胞、成骨細胞和骨髓間充質干細胞釋放入血；骨髓自主神經數量減少也可降低骨髓雪旺細胞數量并快速造成骨髓造血干細胞丟失［13-14］。因此，骨髓神經病變是骨髓功能障礙的一個關鍵因素，而骨髓特異性高表達neuritin轉基因小鼠可作為研究外周神經病變修復的模型鼠，如糖尿病外周神經病變。

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