大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞的PPARγ信號(hào)通路的調(diào)控

段淑芳 胡江

浙江省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州 310005）

糖尿病腎病（DN）是全球終末期腎病的主要原因，終末期腎病有54%來自糖尿病腎病［1］。糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展與炎癥反應(yīng)所致胰島素抵抗密切相關(guān)［2］。前期研究已證實(shí)，大黃酸可以通過減少尿白蛋白排泄量，減緩血肌酐水平的升高，延緩糖尿病腎病發(fā)展，但是具體機(jī)制不明確［3］。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞（mesangial cell，MsC）凋亡率及相關(guān)信號(hào)蛋白氨基末端激酶（p-JNK）和氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）表達(dá)的調(diào)控，闡述大黃酸延緩糖尿病腎病發(fā)展的可能機(jī)制，為糖尿病腎病防治和大黃酸的進(jìn)一步開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥材及制備大黃酸（批號(hào)：20121220，純度：≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)本校中藥鑒定室鑒定屬正品。大黃酸用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，加入無血清DMEM稀釋，并經(jīng)0.22 μm過濾消毒備用。DMSO終濃度小于0.01%，以0.01%DMSO作為溶劑對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)顯示溶劑對(duì)細(xì)胞無毒性作用。

1.2 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，USA）（每升含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素，100 μg/mL的鏈霉素，2 mmol/L的L-谷氨酰胺，100 μM的非必需氨基酸，1 mmol/L的丙酮酸，pH 7.4）；胰酶（MERCK，USA）；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit（Bender Med System）；p-JNK（Thr183/Tyr185）（98F2）Rabbit mAb 和PPARγ（81B8）Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，MA，USA）；GAPDH（Santa Cruz，CA，USA）。RT-PCR試劑盒（TAKARA）；PPARγ引物、BcL-2引物、β-Actin（Invitrogen）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠MsC的體外培養(yǎng)細(xì)胞株MsC購自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司，低糖（5.5 mmol/L）DMEM培養(yǎng)液常規(guī)傳代保存。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組將生長良好的MSC調(diào)整細(xì)胞比例為2×106/培養(yǎng)皿，接種于100 mm dishes，待24 h后細(xì)胞長滿，棄上清更換為無血清培養(yǎng)基，隨機(jī)分組為：（1）正常對(duì)照組（MsC無任何誘導(dǎo)劑）；（2）模型組：MsC+高糖（30 mmol/L）DMEM培養(yǎng)基；（3）MsC+30 mmol/L高糖+大黃酸（250 μg/mL）；（4）MsC+30 mmol/L 高糖+大黃酸（125 μg/mL）；（5）MsC+30 mmol/L 高糖+大黃酸（62.5 μg/mL）。各組更換無血清培養(yǎng)基后先給與相應(yīng)濃度各中藥干預(yù)4 h，再加入終濃度為30 mmol/L的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)作用18 h后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測(cè)大黃酸對(duì)高糖所致大鼠腎臟系膜細(xì)胞凋亡率的影響：然后先用0.25%的胰酶（不含EDTA）消化，1 000 r/min×5 min離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞重懸于195 μL的1×Binding Buffer中，輕輕吹打混勻再轉(zhuǎn)移至5 mL的流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC染色液和5 μL的質(zhì)量濃度為20 μg/mL的碘化丙啶（PI），混勻后室溫下避光孵育15 min，每個(gè)樣品采集約1×105個(gè)細(xì)胞，半小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)凋亡細(xì)胞百分比。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的MsC相關(guān)因子PPARγ、BcL-2的基因表達(dá)cDNA擴(kuò)增采用固定模式：95℃ 4 min；30個(gè)循環(huán)94℃（30 s），56℃（30 s）和72℃（30 s）；72℃ 7 min；最后一步冷卻。引物：Bcl-2的上游引物：5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGG-3′，下游引物：5′-TCACTTGTGGCTCAGATAGGC-3′，退火溫度56℃，擴(kuò)增產(chǎn)物：387 bp。PPARγ 上游引物：5′-GGTTGATTTCTCCAGCATTTC-3′，下游引物：5′-GCTTCAATCGGATGGTTCTT-3′，退火溫度54℃，擴(kuò)增產(chǎn)物311 bp。GAPDH的上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，退火溫度55 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物405 bp。

1.3.5 Western blot半定量檢測(cè)p-JNK和PPARγ含量觀察大黃酸調(diào)控高糖所致大鼠腎臟系膜細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)各組藥物干預(yù)18 h后，棄上清加入200 μL裂解液，刮下細(xì)胞冰上裂解30 min后，12 000 r/min，4℃，離心10 min收集上清，加入等體積2×sample buffer，煮沸10 min，上樣20 μL，160 V電壓電泳60 min后，電流400 A轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗封閉過夜后，TBST洗膜5次，二抗封閉1 h，TBST洗膜5次，然后曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料各組數(shù)據(jù)均采用±s來表示，各組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測(cè)大黃酸對(duì)高糖所致大鼠腎臟系膜細(xì)胞凋亡率的影響高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率達(dá)（75.6±8.2）%與正常組（3.5±0.2）%差異明顯（P＜0.05），不同劑量大黃酸干預(yù)后分別能把細(xì)胞凋亡率降低到（30.9±2.1）%，（44.7±3.8）%，（52.1±6.0）%，與高糖模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明這三種濃度大黃酸均能有效抑制高糖所致的細(xì)胞凋亡（P＞0.05），其中尤其是大劑量組（250 μg/mL）作用最佳，存在劑量依賴關(guān)系。見圖1。

圖1 大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1 Effects of the Rheic acid on the apoptosis rate in rats’mesangial cells induced by high glucose

2.2 大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞凋亡基因（Bcl-2）和氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）的影響與正常組比較，高糖（30 mmol/L）作用于大鼠腎臟系膜細(xì)胞（MsC）后，Bcl-2、PPARγ活性被抑制（0.16±0.04vs0.82±0.07，0.23±0.04vs0.70±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度大黃酸（250、125、62.5 μg/mL）干預(yù)后，BcL-2活性提高分別為0.65±0.06、0.59±0.04、0.27±0.03，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而PPARγ活性分別提高為0.55±0.04，0.49±0.03，0.27±0.05，大黃酸（250、125 μg/mL）組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而大黃酸（62.5 μg/mL）組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞Bcl-2和PPARγ的影響Fig.2 Effects of the Rheic acid on the expression of Bcl-2 and PPARγ in rats′mesangial cells induced by high glucose

2.3 大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞相關(guān)信號(hào)蛋白氨基末端激酶（p-JNK）和氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）的影響與正常組比較，高糖（30 mmol/L）作用于大鼠腎臟系膜細(xì)胞（MsC）后，p-JNK的表達(dá)被激活（0.92±0.07vs0.28±0.03），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度大黃酸（250，125，62.5 μg/mL）干預(yù)后，p-JNK的表達(dá)分別被抑制為0.35±0.06，0.40±0.06，0.56±0.04，大黃酸（250，125，62.5 μg/mL）組與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MsC細(xì)胞的PPARγ表達(dá)能夠被高糖顯著抑制（0.33±0.05vs0.88±0.07）（P＜0.05），不同濃度大黃酸（250，125，62.5 μg/mL）干預(yù)后，PPARγ的表達(dá)分別被提升為0.62±0.07，0.48±0.03，0.41±0.04，大黃酸（250，125 μg/mL）組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而大黃酸（62.5 μg/mL）組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見大黃酸（250，125 μg/mL）可以顯著抑制被高糖激活的P-JNK活性和提高被抑制的PPARγ活性（圖3）。

圖3 大黃酸對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞p-JNK和PPARγ的影響Fig.3 Effects of the Rheic acid on the expression of p-jnk and PPAR in rats’mesangial cells induced by high glucose

3 討論

糖尿病腎病（DN）是發(fā)生終末期腎病的主要原因［1］，糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展與多種通路有關(guān)，包括多元醇途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）途徑、蛋白激酶C（PKC）、氨基己糖途徑、巨噬細(xì)胞激活、內(nèi)皮功能障礙等，而這些通路均與高糖環(huán)境下炎癥反應(yīng)導(dǎo)致胰島素作用信號(hào)缺失相關(guān)［2-3］。目前研究發(fā)現(xiàn)：炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起胰島素抵抗，兩者共同激活體內(nèi)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而產(chǎn)生腎小球系膜細(xì)胞表型和功能的改變，最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生和持續(xù)性進(jìn)展［4-5］，同時(shí)抑制2型糖尿病大鼠循環(huán)中炎癥細(xì)胞因子，可以明顯改善胰島功能，糾正蛋白尿和腎小球肥大等［6-7］。因此在糖尿病腎病干預(yù)治療中，重點(diǎn)是尋找安全有效的藥物，抑制炎癥反應(yīng)，從而改善胰島素抵抗，保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞，最終預(yù)防和延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

胰島素抵抗是一種胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷狀態(tài)，其中過氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）是胰島素作用的重要蛋白［8］，腎系膜細(xì)胞、腎小管細(xì)胞及足細(xì)胞上均存在PPARγ受體。炎癥反應(yīng)與多種信號(hào)通路有關(guān)，其中氨基末端激酶（JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，是炎癥、氧化應(yīng)激引起的死亡途徑的重要組成部分，同時(shí)也與多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。活化的JNK可以通過FasL、Bim等促凋亡蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白表達(dá)，從而啟動(dòng)凋亡進(jìn)程加速腎臟損害［9］，同時(shí)JNK通路可以通過調(diào)控PPARγ的表達(dá)，抑制胰島細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞凋亡，改善胰島素抵抗，延緩腎損傷［10-11］。所以研究糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)靶基因及相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)，增加胰島素敏感性，成為防治糖尿病腎病的靶點(diǎn)。

前期研究［12-13］已證實(shí)大黃酸可以明顯降低尿白蛋白排泄量，預(yù)防血肌酐水平的升高，延緩腎小球系膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。但是具體機(jī)制不明確，限制了大黃的進(jìn)一步開發(fā)和臨床循證使用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大黃酸可以顯著提高抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)，減少高糖所致腎臟系膜細(xì)胞凋亡率，并且存在劑量依賴關(guān)系。同時(shí)，高糖作用于大鼠腎臟系膜細(xì)胞（MsC）后，p-JNK被激活，PPARγ被抑制，符合糖尿病的炎癥反應(yīng)后胰島素抵抗改變。大黃酸干預(yù)組（250 μg/mL和125 μg/mL）均可以有效減少p-JNK的蛋白表達(dá)，提高PPARγ的蛋白表達(dá)，而大黃酸干預(yù)組（62.5 μg/mL）能有效抑制p-JNK，但是不能提高PPARγ的基因和蛋白表達(dá)，考慮可能與改善胰島素抵抗需足量抗炎作用有關(guān)。以上結(jié)果提示大黃酸通過調(diào)控p-JNK改善PPARγ表達(dá)的作用，有效抑制腎臟系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗，延緩糖尿病腎病發(fā)展，存在劑量依賴關(guān)系。但是欠缺阻斷PPARγ表達(dá)后觀察大黃酸對(duì)腎小球細(xì)胞細(xì)胞的作用，有待進(jìn)一步觀察研究，為大黃酸對(duì)糖尿病腎病的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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