恩替卡韋耐藥的慢性乙型肝炎患者序貫挽救治療的臨床療效與病毒學演變分析

邵金曼，劉妍，陳容娟，周怡，趙麗，劉佳梁，李樂，許智慧，徐東平

乙型肝炎病毒(HBV)感染嚴重危害人類健康，持續病毒復制增加了肝硬化和肝癌的發生風險，而抗HBV治療是限制或逆轉疾病進展的關鍵[1]。核苷(酸)類似物(NAs)是臨床上最常用的抗HBV藥物，分為核苷類似物和核苷酸類似物，前者包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)和恩曲他濱，后者包括阿德福韋酯(ADV)和替諾福韋酯(TDF)。NAs因能有效抑制病毒復制、口服方便、價格低廉而在臨床廣泛應用[2]，但長期服用產生的耐藥性可導致治療失敗，是困擾臨床的難題[3]。在近20年的臨床實踐中，我國已積累了相當數量的NAs治療失敗并檢出各種耐藥突變的患者。在2014年TDF被我國批準用于慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治療之前，ETV耐藥患者的挽救治療方案以ETV+ADV為主，但長期應用仍有患者應答不佳，此類患者臨床上換用TDF或TDF+ETV挽救治療的病毒學動態演變特點少見報道。本研究的目的是分析臨床上NAs治療失敗并檢出ETV耐藥突變的HBV感染患者ETV+ADV聯合挽救治療應答不佳、繼續TDF±ETV挽救治療期間的臨床療效與病毒學動態演變特點，為臨床實踐提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2003年7月－2006年12月就診于解放軍302醫院的4例NAs治療失敗并檢出ETV耐藥突變的CHB患者，在接受ETV(0.5mg/d)+ADV(10mg/d)聯合挽救治療后仍應答不佳。4例患者無其他病毒合并感染和其他原因引起的肝病，在接受ETV+ADV聯合治療應答不佳后以TDF(300mg/d)或TDF(300mg/d)+ETV(0.5mg/d)繼續聯合挽救治療，并隨訪觀察至2016或2017年。本研究經解放軍302醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 主要試劑 病毒DNA-OUT提取試劑盒購自北京天恩澤公司；2×EasyTaq PCR SuperMix及Trans109感受態細胞均購自北京全式金公司；膠回收試劑盒購自德國Qiagen公司；pGEM-Teasy載體購自美國Promega公司；T4DNA連接酶購自日本TaKaRa公司。引物合成和基因測序由北京天一輝遠公司完成。

1.3 方法

1.3.1 臨床和實驗室檢查 收集每例患者接受ETV+ADV及換成TDF或TDF+ETV前后的臨床和實驗室數據，包括人口統計資料、NAs治療史及治療時間、HBV抗原抗體等血清學指標、血清HBV DNA水平、血生化指標包括丙氨酸轉氨酶(ALT)、血清肌酐(Cre)和血磷(P)水平等。

1.3.2 HBV RT區基因突變分析與基因型分析 使用病毒DNA提取試劑提取患者血清HBV DNA，采用本課題組創新建立的超靈敏巢式PCR方法擴增HBV RT基因(國家發明專利ZL200910092331.1)[4]。對PCR產物進行DNA雙向測序，對rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt214、rt236和rt250等經典和潛在的LAM、ADV、ETV耐藥相關位點的序列峰圖進行分析。按照文獻[5]中的方法進行HBV基因分型。

1.3.3 基因克隆 將PCR產物直接克隆至pGEMTeasy載體，隨機挑選20個克隆進行DNA序列測定并分析耐藥相關變異。

2 結 果

2.1 患者在挽救治療期間耐藥突變病毒的動態演變特點 4例患者均為男性，年齡44～56歲，平均49.5歲。其中3例患者(P2，P3，P4)HBeAg陽性，2例患者(P1，P4)ALT水平異常(表1)。

4例患者在ETV+ADV治療之前有至少1種NAs治療失敗史，繼而接受ETV+ADV聯合挽救治療。在ETV+ADV治療開始時HBV RT區基因突變分析顯示4例患者均檢出ETV耐藥變異位點(rtM204I/V且同時出現rtT184/rtS202/rtM250這3個位點之一的突變)。HBV RT區基因型分析顯示所有患者均為C基因型(表1)。為了觀察ETV+ADV聯合治療開始時HBV病毒株的動態演變特點，用課題組建立的超靈敏方法(檢測限為20IU/ml，下同)對4例患者不同時間點的血清樣本進行基因克隆(≥20個/樣本)分析，結果顯示P1在ETV+ADV治療開始時克隆結果為rtL180M+rtT184L+rtM204V占100%，均為ETV耐藥株；P2在ETV+ADV治療開始時克隆結果為rtL180M+rtT184A+rtM204V占80%和rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占20%，均為ETV耐藥株；P3在ETV+ADV治療開始時克隆結果為rtV173L+rtL180M+rtM204I+rtM250L占100%，均為ETV耐藥株；P4在ETV+ADV治療開始時克隆結果為rtL180M+rtT184L+rtM204V占94.4%和WT占5.6%，以ETV耐藥株為主(圖1)。

4例患者均接受了40.5(14～63)個月的ETV+ADV聯合治療。ETV+ADV聯合治療后HBV RT區基因突變分析顯示3例患者有ETV耐藥變異位點，此外1例患者無耐藥變異位點，并且除了HBV經典耐藥變異位點還有潛在耐藥變異位點rtV214A。為了觀察ETV+ADV聯合治療后HBV病毒株的動態演變特點，對4例患者不同時間點的血清樣本進行基因克隆(≥20個/樣本)分析，結果顯示P1在應用ETV+ADV治療47個月后克隆結果為rtL180M+rtT184L+rtM204V占75%和rtA181S+rtT184L+rtM204I占25%，均為ETV耐藥株；P2在應用ETV+ADV治療14個月克隆結果為rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占57%和rtL180M+rtT184A+rtM204V占43%，均為ETV耐藥株；P3在應用ETV+ADV治療51個月后克隆結果為WT占79%、rtM250L占11%、rtV173L+rtL180M占5%和rtV173L+rtL180M+rtM204I占5%，以WT為主；P4在應用ETV+ADV治療26個月克隆結果均為WT(圖1)。

表1 ETV+ADV聯合治療前患者基線特征和基因突變形式Tab.1 Baseline characteristics and genotypic mutation patterns of patients prior to combined ETV+ADV therapy (direct PCR sequencing)

圖1 4例患者抗病毒治療期間的臨床特征及HBV耐藥株進化特點Fig.1 Evolution of resistant HBV strains with clinical virology and biochemical response features in 4 cases during antiviral treatment

4例患者在接受了40.5(14～63)個月的ETV+ADV聯合治療后繼續換用TDF或TDF+ETV治療32.5(23～40)個月，HBV RT區基因突變分析顯示1例患者有ETV耐藥變異位點，2例患者無耐藥變異位點，此外，1例患者HBV DNA巢式PCR未檢測出。為了觀察TDF或TDF+ETV治療后HBV病毒株的動態演變特點，對4例患者不同時間點的血清樣本進行基因克隆(≥20個/樣本)分析，結果顯示P1在應用TDF治療23個月后克隆結果全部為WT；P2應用TDF+ETV治療38個月后克隆結果為rtL180M+rtT184A+rtM204V占75%和rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占 25%，均為ETV耐藥株；P3在應用TDF治療40個月后克隆結果全部為WT；P4在應用TDF治療17個月后HBV DNA巢式PCR未檢測出(圖1)。

2.2 患者在挽救治療期間的病毒學、生化學和血清學應答 NAs用藥過程中的HBV DNA和ALT變化見圖1。4例患者在ETV+ADV聯合治療前血清HBV DNA為4.28(2.93～7.45)log10IU/ml，在接受了40.5(14～63)個月的ETV＋ADV聯合治療后HBV DNA下降到2.99(2.36～5.93)log10IU/ml，均未實現血清HBV DNA檢測不到。在ETV+ADV挽救治療期間，P1在治療4個月后ALT水平恢復正常，P4在治療7個月后ALT水平恢復正常，3例患者均未實現HBeAg血清學轉換，4例患者均未實現HBsAg陰轉。隨后4例患者換用TDF或TDF+ETV繼續挽救治療32.5(23～40)個月，P1和P3均在3個月后、P2和P4分別在28和17個月后血清HBV DNA檢測不到(血清HBV DNA ＜40IU/ml)，隨訪15(10～37)個月血清HBV DNA持續檢測不到。4例患者在TDF或TDF+ETV繼續挽救治療期間，ALT波動并維持正常水平，3例患者均未實現HBeAg血清學轉換，4例患者均未實現HBsAg陰轉(表2)。

表2 TDF挽救治療期間4例患者的病毒學、生化學和血清學應答Tab.2 Virological, biochemical and serological responses of 4 patients during TDF rescue treatment

2.3 患者在挽救治療期間的不良反應 4例患者在TDF或TDF+ETV挽救治療10(3～28)個月后血清HBV DNA檢測不到，并在后續隨訪的15(10～37)個月仍維持此水平，ALT水平為15～67U/L，最終均恢復正常(＜40U/L)，均未出現病毒學突破(HBV DNA水平比治療中最低點上升1個log值，或一度轉陰后又轉為陽性)和ALT水平巨大波動(＞2×40U/L)。4例患者隨訪期間血清Cre維持在正常范圍內(62～115μmol/L)，P2在隨訪第9個月時血磷水平下降，但未出現與之相關的臨床癥狀如骨密度減少和骨軟化癥等，在未改變TDF用量的情況下隨訪至38個月血磷水平恢復正常，其余3例患者隨訪期間血磷水平均維持正常(0.9～1.34mmol/L)，未出現與ADV、ETV或TDF相關的不良事件。

3 討 論

多項研究顯示，ETV+ADV對NAs治療失敗的ETV耐受患者具有良好的抗病毒活性[6-8]，但臨床上仍出現了許多ETV+ADV應答不佳的患者。對ETV+ADV治療失敗的ETV耐藥患者的挽救治療選擇是困擾臨床的棘手問題。本研究分析了真實臨床實踐中4例NAs治療失敗并檢出ETV耐藥突變的HBV感染患者先后經歷ETV+ADV聯合挽救治療應答不佳、TDF±ETV繼續挽救治療期間的病毒學演變及臨床療效。4例患者在挽救治療前均檢出ETV耐藥變異位點，這些耐藥變異株可能與患者對ETV+ADV應答不佳有關[9]。此外，患者對ETV+ADV應答不佳也可能與ADV抗病毒活性低和其用藥劑量低(10mg/d)有關[10]。ADV的抗病毒活性與病毒載量有關，當病毒載量很高時，更容易出現ADV應答不佳[11]。本研究的4例患者中有3例在接受ETV+ADV治療前HBV DNA＞3.0log10IU/ml，其中1例患者HBV DNA＞7.0log10IU/ml，因此更易出現ADV應答不佳。此外，分析發現RT區新型ADV耐藥變異rtA181S[12]以及潛在ADV耐藥變異rtV214A[13]的存在也可能是患者對ETV+ADV應答不佳的原因之一。

有多項研究顯示TDF或TDF+ETV對多種NAs治療失敗的患者具有很好的療效[14-17]，但挽救治療期間病毒學動態演變的分析少見報道。本研究證實了ETV+ADV挽救治療應答不佳的ETV耐藥患者以TDF±ETV繼續挽救治療可獲得很好的療效，結合動態克隆演變分析發現，即使臨床挽救治療達到血清HBV DNA檢測不到，仍有可能存在低水平病毒復制。進一步分析發現，TDF±ETV挽救治療后實現完全病毒學應答的快慢可能與病毒株是否持續存在有關。Lim等[18]報道了90例ETV耐藥患者，換用TDF或TDF+ETV治療11個月后85.6%的患者實現了血清HBV DNA檢測不到，僅有少數患者仍有前期存在的耐藥突變形式，與本研究結果相一致，說明ETV耐藥株的消失可能與患者快速實現完全病毒學應答有關。而Gwak等[19]報道了90例ETV耐藥患者分別換用TDF或TDF+ETV治療，33個月后仍有6例患者HBV DNA＞60IU/ml，且其中2例仍可檢出前期存在的耐藥突變形式。本研究中P2在接受28個月的TDF+ETV治療后才實現HBV DNA檢測不到，克隆分析顯示仍存在ETV耐藥突變株，這種慢速實現完全病毒學應答可能是導致TDF+ETV治療后ETV耐藥病毒持續存在的原因。

研究顯示，TDF治療經治患者有較低的HBeAg血清學轉換率和HBsAg陰轉率[20-21]，與本研究結果相一致。此外，低血清學轉換率也可能與基因型有關，與其他基因型相比，C基因型獲得血清學轉換的概率更低，而本研究納入的4例患者均為C基因型[22]。

TDF與ADV類似，均經腎臟排泄，對腎臟功能損傷的病例也頻見報道。TDF相關性腎損傷包括腎小管功能障礙、間質性腎炎、急性腎小管壞死、范可尼綜合征等[23]。因此ADV經治患者換用TDF是否會引起或加重腎損害也引起了臨床關注。多項研究表明，無論是TDF初治還是ADV經治換用TDF均有良好的安全性和耐受性[24-26]。本研究4例患者也未出現與TDF相關的不良事件。

本研究雖然樣本量較少，但均是發生了ETV耐藥且對以往常用ETV+ADV挽救治療效果不佳的患者，隨訪治療時間長達11.09(9.33～13.08)年。本研究證實了ETV+ADV挽救治療應答不佳的ETV耐藥患者以TDF±ETV繼續挽救治療可獲得良好療效，并發現ETV耐藥株檢測不到可能與患者實現病毒學應答的快慢以及早期演變為野生病毒有關，但即使臨床治療達到血清HBV DNA檢測不到，仍有可能存在低水平病毒復制，提示對此類患者需長期應用TDF±ETV抗病毒治療。

[1]Lim YS. Management of antiviral resistance in chronic hepatitis B[J]. Gut Liver, 2017, 11(2): 189-195.

[2]Zhang W, Xu RF, Tian RF, et al. Influence of adefovir dipivoxil versus telbivudine combined with entecavir on liver function and serum virology in hepatitis B patients with decompensated liver cirrhosis[J]. Med J Chin PLA, 2016, 41(12): 1041-1044. [張偉,許榮放, 田銳鋒, 等. 阿德福韋酯與替比夫定聯合恩替卡韋對失代償期乙肝肝硬化患者肝功能及血清病毒學指標的影響[J]. 解放軍醫學雜志, 2016, 41(12): 1041-1044.]

[3]Xu DP, Liu Y. A novel insight of understanding of mechanism of hepatitis B virus drug resistance by combining genotype resistant mutation detection and phenotype resistance analysis[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6): 535-538. [徐東平, 劉妍. 結合基因型耐藥突變檢測與表型耐藥分析探索乙肝病毒耐藥的新認識[J]. 解放軍醫學雜志, 2012, 37(6): 535-538.]

[4]Xu DP, Liu Y, Cheng J, et al. Multiple-site analysis of HBV drug resistant mutations in 340 patients with chronic hepatitis B[J].Chin J Hepatol, 2008, 16(10): 735-738. [徐東平, 劉妍, 成軍,等. 340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位點耐藥相關突變分析[J]. 中華肝臟病雜志, 2008, 16(10): 735-738.]

[5]Liu Y, Zhong Y, Zou Z, et al. Features and clinical implications of hepatitis B virus genotypes and mutations in basal core promoter/precore region in 507 chinese patients with acute and chronic hepatitis B[J]. J Clin Virol, 2010, 47(3): 243-247.

[6]Kim HS, Yim HJ, Jang MK, et al. Management of entecavirresistant chronic hepatitis B with adefovir-based combination therapies[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(38): 10874-10882.

[7]Xu XH, Li GL, Qin Y, et al. Entecavir plus adefovir rescue therapy for chronic hepatitis B patients after multiple treatment failures in real-life practice[J]. Virol J, 2013, 10: 162.

[8]Chae HB, Kim MJ, Seo EG, et al. High efficacy of adefovir and entecavir combination therapy in patients with nucleosiderefractory hepatitis B[J]. Korean J Hepatol, 2012, 18(1): 75-83.

[9]Kim SS, Cheong JY, Lee D, et al. Adefovir-based combination therapy with entecavir or lamivudine for patients with entecavirrefractory chronic hepatitis B[J]. J Med Virol, 2012, 84(1):18-25.

[10]Gallego A, Sheldon J, García-Samaniego J, et al. Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B[J]. J Viral Hepat, 2008, 15(5): 392-398.

[11]Sinn DH, Lee H, Gwak GY, et al. Virological response to adefovir monotherapy and the risk of adefovir resistance[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(30): 3526-3530.

[12]Liu Y, Li X, Xin S, et al. The rtA181S mutation of hepatitis B virus primarily confers resistance to adefovir dipivoxil[J]. J Viral Hepat, 2015, 22(3): 328-334.

[13]Locarnini S, Mason WS. Cellular and virological mechanisms of HBV drug resistance[J]. J Hepatol, 2006, 44(2): 422-431.

[14]Zhang Q, Han T, Nie CY, et al. Tenofovir rescue regimen following prior suboptimal response to entecavir and adefovir combination therapy in chronic hepatitis B patients exposed to multiple treatment failures[J]. J Med Virol, 2015, 87(6): 1013-1021.

[15]Kim JH, Ahn SH, Ko SY, et al. The efficacy of tenofovir-based therapy in patients showing suboptimal response to entecaviradefovir combination therapy[J]. Clin Mol Hepatol, 2016,22(2): 241-249.

[16]Liu Y, Zhang Y, Yuan J, et al. Efficacy of tenofovir disoproxil fumarate therapy in Chinese chronic hepatitis B patients after multiple antiviral failures[J]. Hepatol Res, 2015, 45(10):E43-E52.

[17]Park JY, Kim CW, Bae SH, et al. Entecavir plus tenofovir combination therapy in patients with multidrug-resistant chronic hepatitis B: results of a multicentre, prospective study[J]. Liver Int, 2016, 36(8): 1108-1115.

[18]Lim YS, Byun KS, Yoo BC, et al. Tenofovir monotherapy versus tenofovir and entecavir combination therapy in patients with entecavir-resistant chronic hepatitis B with multiple drug failure:Results of a randomised trial[J]. Gut, 2016, 65(5): 852-860.

[19]Gwak GY, Lim YS, Byun KS, et al. Three-year efficacy and safety of tenofovir disoproxil fumarate monotherapy for entecavirresistant chronic hepatitis B[J]. Hepatol Int, 2017, 11(1): S6.

[20]Suzuki F, Suzuki Y, Hosaka T, et al. Efficacy of long-term tenofovir-based rescue therapy in patients with chronic hepatitis B refractory to nucleoside/nucleotide analogs[J]. J Gastroenterol, 2017, 52(5): 641-651.

[21]Lo AO, Wong VW, Wong GL, et al. Efficacy of tenofovir switch therapy for nucleos(t)ide-experienced patients with chronic hepatitis B[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2015, 41(11): 1190-1199.

[22]Shi YH. Correlation between hepatitis B virus genotypes and clinical outcomes[J]. Jpn J Infect Dis, 2012, 65(6): 476-482.

[23]Perazella MA. Tenofovir-induced kidney disease: An acquired renal tubular mitochondriopathy[J]. Kidney Int, 2010, 78(11):1060-1063.

[24]Manns M, Heathcote J, Marcellin P, et al. 1017 efficacy of tenofovir df treatment in patients with a suboptimal response to adefovir dipivoxil[J]. J Hepatol, 2010, 52(10): S393.

[25]Hou J, Gao Z, Xie Q, et al. 144 weeks tenofovir disoproxil fumarate monotherapy or switching from adefovir dipivoxil after 48 weeks results in potent viral suppression and a favorable safety profile in chinese patients with chronic hepatitis B[J].Hepatol Int, 2015, 9: S30-S31.

[26]Lampertico P, Mangia G, Viganò M, et al. Tenofovir monotherapy is effective for adefovir experienced patients but requires careful monitoring of glomerular and tubular function and proactive dose reductions: A 4-year study in 320 patients[J].Hepatology, 2013, 58(4): 649A-650A.