乙型肝炎病毒rtA181T耐藥相關突變引起的sW172終止與非終止突變的臨床發生特點及表型差異分析

趙麗，李曉東，陳容娟，邵金曼，周怡，思蘭蘭，許智慧，劉妍，徐東平

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的全球性公共衛生問題，據統計，全球大約有2.4億慢性HBV感染者，其中我國有9300萬左右，每年死于HBV相關疾病的人數多達75萬[1-2]。目前核苷(酸)類似物(NAs)是治療HBV感染的主要藥物，主要包括核苷類藥物拉米夫定(LAM)、替比夫定(LDT)、恩替卡韋(ETV)和核苷酸類藥物阿德福韋酯(ADV)、替諾福韋酯(TDF)。ADV是繼LAM之后第2個應用于臨床抗HBV治療的NAs藥物。與其他NAs類藥物作用原理相同，ADV通過抑制HBV反轉錄酶活性進而抑制HBV復制，但對HBV原始復制模板cccDNA無直接抑制作用，因此需要長期用藥[3]。ADV的耐藥基因屏障較低，有研究顯示ADV初治患者5年耐藥發生率為29%[4]。

rtA181T突變的出現與拉米夫定和阿德福韋用藥相關，并可引起對ADV敏感性的輕微下降，但半數最大效應濃度(EC50)值升高＜2倍，單獨出現不足以引起ADV臨床耐藥[5-6]。大多數rtA181T突變可引起相應sW172終止突變，產生的截短型HBsAg易于積聚在內質網則產生內質網壓力，引起氧化應激反應，增加了肝細胞癌的發生風險[7-9]。但少數rtA181T突變也可引起sW172位點非終止突變，包括sW172S和sW172L兩種。目前對非終止突變的臨床發生特點和意義及其表型變化的研究十分有限[10]，缺乏基于大樣本研究的數據。針對上述問題，本研究分析大樣本慢性乙型肝炎患者中rtA181T突變引起S區終止型和非終止型HBsAg的臨床發生特點，并比較兩者在聯合原發ADV耐藥突變rtN236T時對HBsAg表達、病毒復制力和ADV耐藥性影響的差別，以幫助明確rtA181T/sW172非終止突變發生的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2011年7月－2016年7月于解放軍302醫院就診的12 708例乙型肝炎患者血清樣本的測序檢測結果。排除HIV、HDV等混合感染者；排除原發性肝癌患者；排除酒精性肝病及自身免疫性肝病患者；排除原發性肝癌患者?；颊哐鍢颖颈４嬗讪C20℃，所有常規臨床指標均由該院臨床檢驗中心完成。本研究經解放軍302醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 主要試劑 血清中病毒DNA提取采用四川天澤公司DNAout試劑提取盒。PCR試劑盒購自北京全式金公司；pGEM-Teasy載體購自美國Promega公司；Xho Ⅰ/Sph Ⅰ內切酶及T4DNA連接酶購自日本TaKaRa公司；pTriEx-HBV 1.1倍載體由法國里昂大學Zoulim教授惠贈；FuGENE HD轉染試劑盒購自美國Roche公司；DMEM培養基購自Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床和實驗室檢查 收集每例患者接受NAs治療前后的臨床和實驗室數據，包括人口統計資料、NAs治療史、血清HBV DNA水平和生化指標，包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、膽堿酯酶(CHE)等。

1.3.2 HBV RT區基因突變分析及基因型分析 采用病毒DNA提取試劑提取患者血清中的HBV DNA，應用本課題組建立的超靈敏巢式PCR方法擴增HBV RT基因(國家發明專利ZL200910092331.1)[11]。送PCR產物進行雙向測序，對rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt214、rt236和rt250等經典和潛在的LAM、ADV、ETV耐藥相關位點的序列峰圖進行分析。按照文獻[12]中的方法進行HBV基因分型。

1.3.3 基因克隆 將PCR產物克隆到pGEM-Teasy載體，然后隨機挑選≥20個克隆進行DNA測序并分析耐藥相關突變。

1.4 1.1倍pTriEx-HBV重組質粒構建及鑒定 提取rtA181T/sW172S+N236T、rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172stop+N236T和野生型質粒，經Xho Ⅰ和Sph Ⅰ雙酶切后將RT區片段連接至pTriEx–HBV(C)1.1倍載體上，轉化至感受態細胞，接種LB培養板(含有100μg/ml氨芐西林)，37℃培養箱過夜，隨機挑取樣品進行克隆測序，鑒定HBV表達載體構建成功后，制備轉染級相關突變株克隆質粒備用。

1.5 定點突變 根據實驗需要，將rtA181T/sW172stop+N236T進行定點突變回復為N236T突變株。根據原始序列設計1對正反向引物，引物長度為25～50個堿基。以原突變質粒為模板，PCR擴增，產物經甲基化酶Dpn Ⅰ處理，選擇性保留突變成功的質粒。將消化后產物轉化到感受態細胞，37℃過夜，挑選2～3個樣品測序驗證，獲得突變成功質粒。具體方法按試劑盒說明書進行。

1.6 構建1.1倍重組載體轉染細胞檢測復制力及HBsAg水平 轉染前1d將HepG2細胞按1×105個/孔置于24孔板中，待細胞生長至60%～80%融合時，每孔加入0.25μg質粒轉染到HepG2細胞。轉染4h后，分別加入濃度梯度的ADV(0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L)，每2d更換相應藥物濃度的新培養液，連續4d后收集細胞上清，采用實時熒光定量PCR檢測HBV DNA水平。重復實驗3次。病毒的復制力以無藥物壓力下自然產生的HBV DNA水平評價，病毒的藥物敏感性以EC50評價，EC50值越高表明藥物敏感性愈低。

1.7 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計學分析。定量數據以±s或M(Q1，Q3)表示，采用方差分析及兩樣本獨立t檢驗進行比較。定性資料率及組成比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HBV rtA181T突變患者的臨床特點 在12 708例慢性乙型肝炎患者中，有504例(3.96%)患者檢出rtA181T突變，其中男性443例，女性61例，年齡43.0±10.54歲，ALT 47(27～100)U/L，AST 43(27～90)U/L，TBIL 15.20(10.80～25.20)μmol/L，HBV DNA載量4.92±1.86log10IU/ml。根據rtA181T陽性突變患者的性別匹配相應的rtA181T陰性突變患者并對二者進行比較，結果顯示rtA181T陽性突變患者年齡、ALT、CHE、HBV DNA水平顯著高于rtA181T陰性突變患者，差異有統計學意義(P＜0.05)。rtA181T陽性突變患者基因型分布(C型96.03%，B型3.97%)與rtA181T陰性突變患者(C型81.50%，B型18.50%)比較存在顯著差異(P=0.013)。相對于rtA181T陰性突變患者，rtA181T陽性突變患者接受ADV治療的比例更高(表1)。

2.2 rtA181T突變與其他NAs耐藥突變共存情況直接測序結果顯示，有504例患者檢出rtA181T突變，其中有270例rtA181T突變單獨出現，44例伴隨恩替卡韋耐藥突變，31例伴隨拉米夫定耐藥突變，13例伴隨多重耐藥突變(即同時出現核苷類與核苷酸類藥物的耐藥突變)。此外有146例伴隨ADV耐藥突變，包括17例rtA181T+A181V、81例rtA181T+N236T，40例rtA181T+A181V+N236T、5例V173L+L180M+A181T+A181V+N236T、2例L180M+A181T+A181V+N236T和1例L180M+A181T+A181V+N236T(表2)。

表1 rtA181T陽性突變與rtA181T陰性突變患者的臨床資料分析Tab.1 Clinical features of the patients with and without rtA181T mutation

2.3 rtA181T突變的測序峰圖結果 分析504例rtA181T突變病毒測序峰圖出現，其對應sW172突變有1種終止突變和2種非終止突變(L、S)，包括409例(81.1%)sW172stop，29例(5.8%)sW172L，15例(3.0%)sW172L和51例(10.1%)sW172終止與非終止突變株共存；突變株可與野生株(wt)共存(圖1)。

2.4 ADV耐藥患者中rtA181T/sW172stop終止突變與rtA181T/sW172非終止突變的臨床特點 表3比較了ADV耐藥患者中單獨出現的rtA181T/sW172stop突變聯合rtN236T突變與rtA181T/sW172L或sW172S聯合rtN236T突變患者的臨床資料和實驗室檢測指標，結果顯示，兩組患者在年齡、性別、ALT、AST、CHE等方面差異無統計學意義，但前一組患者血清HBV DNA水平明顯低于后一組(3.63log10IU/ml vs. 5.07log10IU/ml，P=0.013)。

2.5 體外實驗突變株HBsAg、HBV DNA水平測定及表型耐藥分析 羅氏定量結果顯示，轉染rtA181T/sW172stop+N236T突變株重組質粒后，HepG2細胞上清中的HBsAg低于檢測下限，而rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T突變株重組質粒后HBsAg表達水平僅較野生株輕微降低(圖2A)。病毒復制力檢測顯示，rtA181T/sW172stop+N236T突變株復制力水平相對于野生株低于rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T突變株(P＜0.05，圖2B)。表型耐藥分析結果顯示，rtA181T/sW172stop+N236T、rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T病毒株與對應野生株相比，其對ADV的耐藥倍數分別為3.69倍、5.49倍、7.38倍。rtA181T/sW172stop+N236T病毒株對ADV的敏感性高于rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T病毒株(表4)。

表2 rtA181T突變與其他NAs耐藥突變共存情況Tab.2 The mutants concomitancy of rtA181T mutant and other nucleoside (acid) analogues resistant mutants

圖1 rtA181T突變引起S區172編碼序列改變的類型Fig.1 Changes of S gene 172 amino acid coding sequence caused by rtA181T mutation

表3 ADV耐藥患者中rtA181T/sW172非終止突變與終止突變的臨床資料比較Tab.3 Clinical features of ADV resistant patients with rtA181T/sW172stop and non-stop mutations

圖2 培養上清中HBsAg定量結果(A)和突變株復制力評價(B)Fig.2 Quantitation of HBsAg in supernatant (A) and assessment of viral replication capacity of mutant strain (B)Dashed line represents lower limit of detection for HBsAg (0.05IU/ml). (1)P＜0.05 compared with wild type

表4 ADV對野生型及4種突變型病毒株的EC50比較Tab.4 Phenotypic resistance of wild type and 4 ADV-resistant mutants

3 討 論

以往ADV曾經作為臨床一線藥物被廣泛使用，雖然我國2015年的《慢性乙型肝炎防治指南》已將ETV和TDF列為一線臨床抗病毒藥物[13]，但受經濟條件和用藥習慣等因素的影響，臨床上ADV的應用仍占有相當比例。常見的ADV原發耐藥突變有rtN236T和rtA181V[14]，此外還有本課題組前期發現的rtN236V和rtA181S[15-16]。一般認為，當突變株對ADV的EC50達到野生病毒株的2倍以上時可引起耐藥[17]。以往有研究顯示，rtA181T、rtAN236T、和rtA181V突變株對ADV的EC50值分別為野生株的1.2±0.5倍、7.0±4.1倍和4.3±1.2倍[5]。rt181T雖然不是原發ADV耐藥突變，但與ADV用藥相關，被認為是一種非典型的ADV耐藥相關突變。大多數rtA181T突變可導致sW172終止突變，影響HBsAg的表達和分泌[7]，但以往缺少對rtA181T/sW172非終止突變的認識，最近有研究揭示了rtA181T/sW172終止突變與rtA181T/sW172L突變對病毒復制、HBsAg表達和分泌具有不同影響[18]，但至今尚未見rtA181T/sW172非終止突變發生特點的臨床大樣本分析及其聯合原發ADV耐藥突變時耐藥性變化的報道。

本研究應用直接測序法分析了12 708例慢性HBV感染者的耐藥突變信息，檢出的rtA181T突變患者占3.96%。74.6%的rtA181T突變患者有ADV治療史，表明rtA181T突變與ADV用藥相關。146例rtA181T突變與ADV耐藥突變共同出現，其中有81例rtA181T與N236T共同出現。本研究結果顯示，rtA181T/sW172stop+N236T突變株的復制力顯著低于rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T突變株；rtA181T/sW172stop+N236T突變株對ADV的耐藥性與野生株相比提高了3.69倍，而rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T對ADV的耐藥性則分別提高了5.49倍和7.83倍。病毒的耐藥性及自然復制力是決定病毒株在藥物壓力下復制競爭力強弱的兩個要素，rtA181T/sW172非終止突變株的ADV耐藥性提高應與其自然復制力較高密切相關，但由于rtA181T/sW172非終止突變株需要同時出現兩種核苷酸突變，限制了其發生。此外，病毒對機體免疫反應性的適應性也可影響病毒的復制競爭力。rtA181T/sW172終止突變可導致產生截短型HBsAg，引起一個CTL重要表位env335-343(即s172-180)的缺失[19]。HBV從rtA181T/sW172終止突變轉變為rtA181T/sW172非終止突變時，雖然病毒的復制力可增加，但可能引起該表位特異性CTL的攻擊?？傊?，rtA181T/sW172非終止突變的發生取決于病毒、藥物與機體免疫三方面的綜合影響，其具體機制還需要更深入的研究。

本研究證實，在體外實驗中rtA181T/sW172終止突變可導致HBsAg分泌表達缺陷，而rtA181T/sW172非終止突變對HBsAg分泌表達的影響較小，但攜帶兩種突變病毒的患者HBsAg水平并無明顯差異，分析原因是大多數患者體內rtA181T突變株與野生株共存，即使未檢出與野生株共存，由于PCR直接測序法只能檢測到20%以上的病毒序列，仍可能與少量野生株共存，提供病毒所需的HBsAg。本研究結果還表明，rtA181T/sW172終止突變聯合rtN236T突變株的病毒復制力明顯低于兩種rtA181T/sW172非終止突變聯合rtN236T突變株，這與我們觀察到的臨床現象相符，即感染rtA181T/sW172stop+N236T突變病毒的患者HBV DNA水平顯著高于感染rtA181T/sW172L或sW172S+N236T突變病毒的患者(表2)，提示與rtA181T/stop+N236T突變株相比，rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T突變株引起的病毒學反跳水平較高，更應引起臨床重視。

總之，本研究通過對大樣本的臨床患者進行測序，明確了我國慢性HBV感染患者rtA181T/sW172非終止突變的臨床發生特點，明確了在聯合rtN236T突變時，rtA181T/sW172非終止突變可較非終止突變賦予病毒更高的ADV耐藥性，這些發現加深了對HBV耐藥突變的認識，可為臨床合理監控耐藥提供幫助。

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