臨床大樣本肝病患者隱匿性HBV感染檢出情況及其HBV S基因免疫逃逸突變特點分析

張凱，徐東平，陳容娟，趙麗，劉璐潔，林亞云，李奇，思蘭蘭，李曉東，李進，藺淑梅，劉妍

我國約有9 300萬慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者，每年有近30萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化(LC)和肝細胞癌(HCC)[1-2]。乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是診斷HBV感染、判斷抗HBV療效的重要指標，但有部分HBV感染者血清HBsAg陰性，而血清和(或)肝組織中可以檢測到HBV DNA，被稱為隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)[3]。OBI與HBV漏診、輸血傳播、乙肝再激活等密切相關。既往研究顯示HBV S基因突變與一部分OBI發生密切相關[4-5]。HBsAg由HBV S基因編碼，其主要親水區(major hydrophilic region，MHR)是中和抗體作用的主要靶區域，對HBsAg抗原性具有重要意義，已發現的OBI相關免疫逃逸突變多位于MHR[6-7]，目前國內外已報道的主要OBI相關MHR免疫逃逸突變達數10種。本課題組前期從1例OBI患者、3例OBI獻血員血清中鑒定了9種代表性MHR免疫逃逸突變株，體外實驗研究發現這9種突變HBsAg的抗原性較野生型HBsAg的抗原性明顯降低，是引起OBI表現的主要原因之一，并證實突變HBsAg影響當前HBsAg臨床診斷試劑的檢出能力[8-9]。OBI呈全球性分布，目前已報道的OBI主要見于獻血員、HCV或HIV等共感染、免疫受抑制者及健康人群等，大樣本研究主要集中于獻血員，關于大樣本臨床肝病患者中OBI檢出率少見報道。本研究回顧性分析11 650例肝病患者，探討肝病患者OBI的檢出率以及其HBV S基因MHR免疫逃逸突變特點，并與低滴度、中高滴度HBsAg的慢性乙型肝炎(CHB)患者中檢出的MHR免疫逃逸突變進行對比分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 借助本課題組建立的涵蓋多種肝臟疾病的HBV基因數據庫，回顧性分析于2007年7月－2011年8月在解放軍302醫院就診并進行HBV DNA直接測序的11 650例肝病患者樣本，調取所有樣本對應的臨床診療資料及HBV直接測序信息。OBI診斷標準依據2008年歐洲肝臟研究學會(EASL)在意大利發布的專家共識[3]，即指通過現有技術檢測血清HBsAg陰性，但血清和(或)肝組織HBV DNA陽性，由于缺乏肝組織HBV DNA檢測，該回顧性研究只分析了血清HBsAg陰性、血清HBV DNA陽性的OBI患者。CHB、HCV感染、LC、HCC等診斷按照我國相關最新指南和診療規范的診斷標準執行[2,10-11]。

1.2 篩選方法 本研究從HBV基因數據庫篩選有血清HBsAg檢測結果的患者，調取血清HBsAg陰性、HBV DNA陽性人群即OBI患者的基本臨床資料以及HBV血清學檢測結果，并查找已成功測序的HBV S基因序列，鑒定基因型；同時篩選具有低滴度(5IU/ml≤HBsAg≤50IU/ml)、中高滴度(HBsAg ≥400IU/ml)HBsAg并已成功測序的患者，排除合并LC、HCC、HCV感染等疾病的患者，鑒定基因型，選擇年齡、性別、基因型與OBI組相匹配的CHB患者作為對照組，對比OBI組與兩組不同HBsAg滴度的CHB患者MHR突變檢出情況。

1.3 基因型鑒定 根據所測定的HBV S基因序列，應用MEGA4軟件構建系統進化樹并進行遺傳距離分析，鑒定基因型。

1.4 HBV S基因MHR序列分析 用MegAlign軟件分析直接測序獲得的HBV S基因核酸序列，比對并鑒定MHR免疫逃逸突變，目前國內外已報道的主要OBI相關MHR免疫逃逸突變見表1。HBV標準序列(序列號：AY217378C1、AF458664C2、X75656C3、AB048704C4、D00329B1、AB073823B2、AB033554B3、AB073835B4)來自于NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi)。

表1 文獻報道的主要OBI相關HBV S基因MHR免疫逃逸突變[8,12]Tab.1 Previously reported major HBV S-gene MHR immune-escape mutations associated with OBI[8,12]

1.5 血清HBV標志物定性及HBsAg與HBV DNA定量檢測 均送往我院檢驗科完成。采用Roche公司Elecsys定性試劑檢測血清HBV標志物，采用HBsAg Elecsys定量試劑檢測血清HBsAg(檢測下限為0.05IU/ml)；采用實時熒光定量PCR檢測血清HBV DNA(檢測下限為40IU/ml)。

1.6 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床大樣本肝病患者中OBI的檢出率 11 650例肝病患者中共計6996例患者進行血清HBsAg定量檢測，其中5752例血清HBV DNA陽性，從中篩出血清HBsAg陰性且HBV DNA陽性的OBI患者12例，因此OBI檢出率為0.172%(12/6996)。同時分別篩選出年齡、性別、基因型與OBI組相匹配的低滴度和中高滴度HBsAg并有直接測序結果的CHB患者32例和50例作為對照組。詳細篩選流程見圖1。

2.2 OBI患者基本特征 12例OBI患者的血清抗-HBc均為陽性，其中8例伴抗-HBs陽性，3例伴抗-HBe陽性。有1例患者(P9)為HCV感染相關LC患者，該患者于30年前患急性乙肝；11例既往為CHB患者。有7例患者既往服用包括阿德福韋酯和拉米夫定在內的NAs進行抗病毒治療。12例OBI患者基本資料見表2。

圖1 OBI患者篩選流程圖Fig.1 Flow chart of OBI patient selection

表2 12例OBI患者基本資料Tab.2 Basic information of 12 OBI patients

2.3 OBI患者與CHB患者MHR免疫逃逸突變對比

12例OBI患者中有8例直接測序成功，且此8例既往均被診斷為CHB，其中6例檢出存在HBV S基因MHR免疫逃逸突變(75%，6/8)；低滴度HBsAg組共有8例檢測出MHR突變(25%，8/32)，結合表1顯示包括經典突變sG145R在內的9種是已報道的OBI相關MHR突變；中高滴度HBsAg組共有20例存在MHR突變(40%，20/50)，主要突變包括sL110I、sT113S、sS143T、sR160K和sF161Y，除sS143T外均不是已報道且公認的OBI相關突變。將8例(P2-P8、P12)已成功測序的OBI患者與低滴度HBsAg組和中高滴度HBsAg組的CHB患者臨床資料及MHR突變信息進行對比分析，OBI組均為C基因型，低滴度HBsAg組B、C基因型分別為4例(4/32)和28例(28/32)，中高滴度HBsAg組B、C基因型分別為9例(9/50)和41例(41/50)。3組患者服用NAs抗HBV治療人數比例分別為62.50%、56.25%和70.00%(P=0.453)，MHR突變率分別為75.00%、25.00%和40.00%(P=0.029，表3)。

表3 OBI與不同滴度HBsAg的CHB患者MHR免疫逃逸突變檢出情況Tab.3 Detection of MHR immune-escape mutations in OBI and CHB patients with different HBsAg levels

3 討 論

OBI呈全球性分布[4,7,13]，截至目前HBV高、低流行區域均報道有OBI檢出，但其流行情況報道差異較大，這與HBV流行地區、檢測方法、調查人群及調查時間段等有關。有研究報道OBI檢出率在獻血員中為0.002%～18.670%[7,14-18]，在HCV感染人群中為8.6%～39.2%[19-21]，還有HIV共感染、血液透析、接受經免疫抑制劑或化療藥物治療及健康人群等也多檢出OBI。但目前缺乏關于肝病人群中OBI流行情況及與HBV S基因MHR免疫逃逸突變相關性等方面的臨床大樣本研究。

本研究在6996例肝病患者中檢出12例OBI患者，檢出率(0.172%，12/6996)明顯高于我國2015年以來獻血員人群的OBI發生率(0.015%～0.097%)[17,22-24]。如表2所示，本研究篩選出的OBI患者均與HBV感染相關。研究結果顯示數據庫中大樣本篩選出的OBI患者多數(7例，58.33%)是接受NAs藥物抗病毒治療后HBsAg轉陰或發生血清學轉換的患者，病毒多呈低、中水平復制。從結果可以看出肝病患者OBI與獻血員OBI具有不同的特點，本研究中OBI患者的血清抗-HBc均為陽性，HBV DNA復制水平高于獻血員OBI，具有明確的HBV感染史，且多數經歷過抗病毒等干預治療。需要注意的是，本研究納入的均為血清HBV DNA陽性樣本，已知血清HBV DNA呈間歇性出現，并且臨床上還存在一部分血清HBV DNA陰性但肝組織中HBV DNA陽性的OBI，因此整體肝病人群中的OBI檢出率可能會高于本研究結果。

近年來HBsAg清除或消失成為判斷HBV臨床治愈的主要指標之一，HBV臨床治愈指持續病毒學應答且HBsAg陰轉或伴有抗-HBs陽轉、ALT正常、肝組織學病變輕微或無病變[2]。本研究提示一部分“臨床治愈”的患者血清HBsAg陰性或低于檢測下限是一種假象，可能處于OBI狀態，病毒繼續復制，肝臟炎癥活動仍繼續，有不斷進展甚至發生HCC的風險，另外如果接受免疫抑制劑等治療或罹患其他疾病使免疫系統受到強烈抑制，HBV可再次被激活，因此建議對于治療后血清HBsAg陰性患者仍應定期復查病毒學及肝臟炎癥活動相關指標。

本研究中8例OBI患者HBV DNA測序成功，其中有6例發生MHR突變，涉及10個氨基酸(aa)位點，包括經典免疫逃逸突變sG145R，由于該組樣本例數少，不能據此判定哪些突變與OBI相關，但結合表1匯總的已報道的主要OBI相關HBV S基因突變，認為MHR突變sQ101R/H、sL109R、sG112K、sK122R、sI/T126S、sA128V、sM133I/T、sG145R和sE164D均可能與OBI發生相關。低滴度HBsAg組CHB患者中有8例檢出MHR突變，其中sL110I、sT113S、sS143T、sR160K和sF161Y最為多見；中高滴度HBsAg組CHB患者中有20例檢出MHR突變，主要的突變為與低滴度HBsAg組突變檢出情況一致，除sS143T突變外，其余4種突變均不是目前已報道的主要OBI相關MHR免疫逃逸突變，提示并非所有MHR突變均與OBI發生相關，推測不同MHR突變的機制及作用方向不同。

我國傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心對38 499例HBsAg陰性獻血員進行的大樣本回顧性分析研究顯示，在OBI組、低滴度HBsAg組(0.05～100IU/ml)、高滴度HBsAg組(＞100IU/ml)MHR突變率分別為55.7%(34/61)、34.0%(52/153)和13.0%(7/54)，即隨著HBsAg滴度越高，突變率越低[7]。本研究中OBI與低滴度、中高滴度HBsAg的CHB患者MHR突變率分別為75.00%、25.00%和40.00%，OBI組的MHR突變率明顯高于其他兩組(P=0.029)，而中高滴度HBsAg組MHR突變檢出率反而高于低滴度HBsAg組，與上述研究結果不完全一致。分析兩項研究結果不一致的原因除研究人群、HBsAg分層方法及樣本數量等因素外，其中一個重要的原因可能在于NAs抗病毒藥物的使用。

本研究中3組NAs藥物服用率分別為62.50%、56.25%、70.00%(P=0.453)，即3組中多數患者均進行抗病毒治療。HBV S基因突變主要在自然條件、預防接種或抗病毒治療等條件下產生[4]。近期一項研究顯示NAs治療組免疫逃逸突變率明顯高于未治療組(24.4% vs. 10.9%，P＜0.05)，且11種聯合突變僅出現在NAs治療組，其中9種不伴隨耐藥突變，即免疫逃逸突變的出現不是因為耐藥突變所引起[25]。Lacombe等[26]學者在抗HBV治療隨訪過程中發現，HBV S基因相關疫苗逃逸突變株隨時間不斷穩定增加。結合諸多學者的研究結論，我們考慮本研究中的HBV S基因MHR突變應該主要是在NAs治療壓力條件下產生，因此CHB患者組也有較高的MHR突變檢出率。目前強效、高耐藥基因屏障的NAs仍是抗HBV的一線用藥，所以在抗病毒治療過程中尤其進行長期NAs治療時應關注HBV S基因突變及OBI的發生。

值得注意的是，OBI組的血清抗-HBs陽性率高達75.00%，明顯高于其他兩組CHB患者。這可能與突變HBsAg誘導產生低結合力的抗-HBs抗體，進而產生位阻效應干擾HBsAg檢測試劑檢測有關。近期我國一項研究納入兩組CHB患者，組Ⅰ為145例抗-HBs陽性的患者，組Ⅱ為141例血清抗-HBs陰性的患者，研究顯示組Ⅰ的“a”決定簇突變率明顯高于組Ⅱ(4.05% vs. 1.22%，P＜0.05)，進一步分析發現組Ⅰ中包括sG145R在內的突變削弱了源于疫苗接種人群的抗-HBs抗體的中和能力[27]。

綜上所述，本研究中肝病患者OBI發生率高于近幾年報道的我國獻血人員的OBI發生率；多數OBI中檢出的MHR突變是已報道的OBI相關MHR免疫逃逸突變，其產生與NAs抗病毒藥物治療壓力關系密切，應引起重視；OBI中檢出的MHR突變是已報道的OBI相關MHR免疫逃逸突變，而在不同HBsAg滴度的CHB患者中檢出的MHR突變大多不是已報道且公認的OBI相關突變，提示并非所有的MHR突變均能引起OBI表現。

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