重癥中暑大鼠血小板計(jì)數(shù)和功能動(dòng)態(tài)變化研究

殷惠梅，陸勇，施學(xué)智，余保軍，吳明，陳榮琳，童華生

中暑是一種嚴(yán)重威脅軍民生命的疾病，表現(xiàn)為中心體溫超過40℃，而重癥中暑常出現(xiàn)伴隨彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)的多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。重癥中暑病死率可達(dá)40%～70%，即使接受ICU治療，其病死率仍高達(dá)63%[1]。重癥中暑的發(fā)病機(jī)制目前仍不是十分清楚，近年研究發(fā)現(xiàn)基于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生的微血栓和炎癥網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)是中暑多臟器功能損害產(chǎn)生的根本發(fā)病機(jī)制[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥與血栓形成之間存在基于血管內(nèi)皮為媒介的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，血小板功能的激活在這種網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。病理狀態(tài)下血小板激活通過表達(dá)、儲(chǔ)存或合成釋放大量的活性因子，調(diào)控基于血管內(nèi)皮平臺(tái)形成血栓和炎癥反應(yīng)[4-5]。早期臨床發(fā)現(xiàn)，輕癥中暑患者即出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)下降，患者體溫升高達(dá)41℃以上時(shí)下降更明顯[6]。我們團(tuán)隊(duì)通過病例回顧發(fā)現(xiàn)，重癥中暑患者血小板計(jì)數(shù)下降提示死亡率增加，可作為預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)[7-8]。然而，血小板是否參與重癥中暑微血栓和炎癥網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)，同時(shí)其數(shù)量和功能相關(guān)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律目前尚不清楚。本研究旨在觀察重癥中暑大鼠血小板數(shù)目和功能的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為進(jìn)一步探討血小板參與重癥中暑的發(fā)病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，7～8周齡，體重265±5.0g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，廣州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，大鼠不受限制獲得合格的食物及水源。使用高溫氣候人工培養(yǎng)箱(寧波戴維)制備動(dòng)物模型。流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessaTM)，血液細(xì)胞分析儀(BC-3000，深圳邁瑞)，LBY-NL4A全自動(dòng)血小板聚集儀(泰利康信)，Sonoclot全血凝血功能和血小板功能分析儀(Sienco Inc，USA SCP-2)，CD61-FITC和CD62P-PE抗體(Biolegend公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及分組 涉及動(dòng)物的所有實(shí)驗(yàn)方案獲得了廣州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物喂養(yǎng)及使用委員會(huì)的支持，并通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。由于雌激素對(duì)熱打擊具有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)均采用雄性SD大鼠。30只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為常溫(sham)組、重癥中暑復(fù)溫0h組(HS-0h)、重癥中暑復(fù)溫3h組(HS-3h)、重癥中暑復(fù)溫6h組(HS-6h)和重癥中暑復(fù)溫9h組(HS-9h)，每組6只。常溫組將動(dòng)物放置在環(huán)境溫度22.0±0.5℃和濕度50%±5%的條件下，重癥中暑組將大鼠置于長(zhǎng)4m，寬3m，高2m的人工培養(yǎng)箱，溫度39.5±0.2℃，相對(duì)濕度60%±5%，兩組均撤去食物和水，每10min經(jīng)直腸測(cè)中心體溫(core temperature，Tc)，Tc達(dá)到43℃即判定為重癥中暑發(fā)生[9]。重癥中暑發(fā)生后，立即記錄時(shí)間，并將大鼠移出人工培養(yǎng)箱，稱重。常溫條件下復(fù)溫，并給予充足的食物和水。常溫對(duì)照組動(dòng)物不進(jìn)行熱暴露，常溫放置相同時(shí)間后給予充足食物和水，其他實(shí)驗(yàn)步驟相同。

1.2.2 腹主動(dòng)脈采血及血小板計(jì)數(shù) 10%水合氯醛(0.3ml/100g)進(jìn)行腹腔注射麻醉，枸櫞酸鈉抗凝管腹主動(dòng)脈采血，取50μl全血，用血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)、血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)。

1.2.3 血小板分離和純度鑒定 取枸櫞酸鈉抗凝血3ml于無菌硅化玻璃管內(nèi)，150×g離心8min獲富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，小心吸取上3/4 PRP至新管中，加入2倍體積含Apyrase的枸櫞酸-枸櫞酸鈉-葡萄糖保存液(acid-citrate-dextrose，ACD)(Apyrase:AC=1:100)，800×g離心10min，棄上清，血小板重懸液(Hepes-Tyrode buffer)調(diào)節(jié)血小板濃度為106～107/L。流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面特異性標(biāo)記物CD61-FITC(1:1000，25℃避光反應(yīng)20min)進(jìn)行血小板純度鑒定。

1.2.4 血小板活化標(biāo)記物CD62P表達(dá)檢測(cè) 取上述血小板懸液，先后加入CD61-FITC(1:1000)和CD62P-PE(1:500)，25℃避光反應(yīng)20min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙陽性血小板比率。

1.2.5 血小板最大聚集率檢測(cè) 采用血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)PRP濃度，吸取PRP，剩余血液1000×g離心10min，上清為乏血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，用PPP調(diào)整PRP濃度為400～500×109/L，取300μl血小板懸液和PPP加入全自動(dòng)血小板聚集儀，誘導(dǎo)劑為二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，濃度為150μmol/L，配套有磁珠和試管。使用比色法檢測(cè)血小板最大聚集率。

1.2.6 血小板功能(PF)檢測(cè) 取新鮮未抗凝動(dòng)脈血500μl加入Sonoclot全血凝血和血小板功能分析儀的試杯中，通過體外激活內(nèi)源性凝血途徑來模擬凝血全過程檢測(cè)血小板PF值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用Oneway ANOVA分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熱打擊后大鼠體重和中心體溫變化 大鼠達(dá)重癥中暑時(shí)間和相關(guān)生理參數(shù)變化見表1。熱打擊前sham組和重癥中暑組Tc為36.7±0.2℃，采用Tc 43℃作為重癥中暑標(biāo)準(zhǔn)，重癥中暑組大鼠Tc增加6.3±0.2℃，sham組大鼠Tc(36.7±0.2℃)無變化。大鼠重癥中暑發(fā)生時(shí)間為172.5±9.0min。熱打擊前大鼠體重sham組(266.5±2.4g)和重癥中暑組(266.7±2.7g)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重癥中暑發(fā)生時(shí)sham組大鼠體重261.0±2.5g，減輕5.5±1.2g，重癥中暑組大鼠體重238.5±4.2g，減輕28.3±3.7g。與sham組比較，重癥中暑組大鼠體重變化和Tc變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

2.2 血小板分離純度鑒定 采用血小板特異性抗體CD61-FITC檢測(cè)分離出來的血小板純度，為94%±2%(圖1)，提示本實(shí)驗(yàn)采用的血小板分離方法所得血小板純度較高，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 重癥中暑血小板數(shù)量動(dòng)態(tài)變化 與sham組[(814.3±17.8)×109/L]比較，復(fù)溫0h組[(625.7±17.8)×109/L，P＜0.01]和3h組[(521.3±11.9)×109/L，P＜0.001]呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，復(fù)溫3h組較復(fù)溫0h組血小板計(jì)數(shù)下降(P＜0.05)，提示重癥中暑早期即出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)下降，且呈時(shí)間依賴性。與復(fù)溫6h組[(417.3±6.1)×109/L]比較，復(fù)溫9h組[(259.3±124.1)×109/L，P＜0.01]繼續(xù)下降，提示重癥中暑晚期血小板計(jì)數(shù)繼續(xù)呈時(shí)間依賴性下降(圖2)。

2.4 重癥中暑血小板CD62P表達(dá)動(dòng)態(tài)變化 Sham組血小板CD62P-PE陽性率為1.7%±0.3%，隨復(fù)溫時(shí)間延長(zhǎng)，各組活化率逐漸上升。與sham組比較，復(fù)溫0h組(4.2%±0.3%，P＜0.05)，復(fù)溫3h組(6.7%±0.2%，P＜0.05)，復(fù)溫6h組(9.6%±1.7%，P＜0.05)和復(fù)溫9h組(19.1%±3.2%，P＜0.001)血小板活化率均上升。血小板活化率的升高呈時(shí)間依賴性(圖3)。

2.5 重癥中暑血小板最大聚集率動(dòng)態(tài)變化 正常大鼠血小板最大聚集率為73.5%±2.0%。從重癥中暑早期即開始出現(xiàn)血小板最大聚集率下降，至復(fù)溫9h降至最低，血小板最大聚集率隨復(fù)溫時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行性下降(圖4)。

表1 重癥中暑大鼠中心體溫和體重變化Tab.1 Changes of the core temperature and body weight of severe heatstroke rats (±s)

表1 重癥中暑大鼠中心體溫和體重變化Tab.1 Changes of the core temperature and body weight of severe heatstroke rats (±s)

BW. Body weight; Tc. Core temperature

Item Sham group(n=6)HS group(n=24) P value BW pre-heating (g) 266.5±2.4 266.7±2.7 BW post-heating (g) 261.0±2.5 238.5±4.2 BW change (g) 5.5±1.2 28.3±3.7 ＜0.001 Heat exposure time (min) 0 172.5±9.0 Tc pre-heating (℃) 36.7±0.2 36.7±0.2 Tc post-heating (℃) 36.7±0.2 43 Tc change (℃) 0 6.3±0.2 ＜0.001

圖1 血小板純度檢測(cè)Fig.1 Detection of platelet purity

圖2 各組大鼠血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)Fig.2 Platelet counts of rats in each group

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠血小板CD62P表達(dá)水平Fig.3 CD62P expression levels in platelets of rats in each group detected by flow cytometry

圖4 各組大鼠血小板最大聚集率檢測(cè)Fig.4 The maximum aggregation rate of platelets in each group of rats

2.6 重癥中暑血小板功能動(dòng)態(tài)變化 Sham組PF值為3.7±0.6，HS-0h組為3.0±0.3，HS-3h組為2.8±0.7，HS-6h組為2.3±0.7，HS-9h組為1.3±0.3。組間比較可見血小板功能呈時(shí)間依賴性下降(P＜0.001，圖5)。

圖5 各組大鼠血小板功能檢測(cè)Fig.5 Detection of platelet function of rats in each group

3 討 論

血小板減少是重癥中暑的常見現(xiàn)象，有研究認(rèn)為血小板以積極主動(dòng)而非被動(dòng)黏附至血管內(nèi)皮的方式參與了重癥中暑微血栓的形成[10]。我們通過對(duì)176例重癥中暑進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，重癥中暑早期血小板計(jì)數(shù)下降提示病死率增加，可作為預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)[8]，提示血小板可能參與了重癥中暑的發(fā)病機(jī)制。但目前對(duì)重癥中暑患者血小板數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律還不清楚。本研究觀察重癥中暑大鼠血小板動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)下降在早期即出現(xiàn)，且呈時(shí)間依賴性，分析機(jī)制可能如下：①高熱損傷血小板：重癥中暑患者中心體溫達(dá)40℃以上，高熱可直接損傷血小板，觸發(fā)血小板凋亡機(jī)制，包括線粒體膜電位下降，磷脂酰絲氨酸暴露和Caspase-3依賴性蛋白的分裂，以及血小板糖蛋白Iba的脫落[11]；②炎癥介質(zhì)損傷血小板：重癥中暑存在嚴(yán)重且廣泛的組織細(xì)胞壞死，釋放多種炎癥介質(zhì)[9,12]，大量炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)血小板發(fā)生凋亡和壞死[9,13]，造成血小板數(shù)目的減少。

凝血功能紊亂是重癥中暑的突出特點(diǎn)[14]。血小板數(shù)量和功能在凝血反應(yīng)中起著重要作用[15]。重癥中暑患者血小板數(shù)目出現(xiàn)下降，血小板功能的動(dòng)態(tài)變化是否參與重癥中暑還不是十分清楚。CD62P稱為血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白或P-選擇素，屬于細(xì)胞黏附分子中的選擇素家族，正常情況下不表達(dá)或低水平表達(dá)，在血小板活化時(shí)與血小板表面的質(zhì)膜融合，顯著表達(dá)于血小板膜上[16]，為血小板活化的特異性標(biāo)志物[17]。CD62P介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞及多種血細(xì)胞及血小板之間的黏附，參與血小板聚集、血栓形成、炎癥和免疫反應(yīng)，激活中性粒細(xì)胞，釋放血管活性物質(zhì)、氧化代謝產(chǎn)物，促使纖維蛋白原沉積等生物學(xué)效應(yīng)發(fā)生，使血管內(nèi)皮的損害加重。我們首先研究重癥中暑血小板CD62P的變化。研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑發(fā)生后血小板CD62P的比例持續(xù)上升，在重癥中暑晚期達(dá)到最高，表明重癥中暑過程中血小板持續(xù)受到損傷性刺激，但是中暑血小板具體功能的動(dòng)態(tài)變化還有待研究。血小板聚集性是血小板的重要功能之一，研究顯示，體外熱打擊血小板，溫度達(dá)43～44℃時(shí)血小板聚集性不可逆性增高，溫度達(dá)45℃時(shí)聚集性受抑制[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在重癥中暑發(fā)生時(shí)血小板最大聚集率即出現(xiàn)下降，隨復(fù)溫時(shí)間延長(zhǎng)，最大聚集率進(jìn)一步下降，在9h達(dá)最低。表明重癥中暑血小板的聚集功能受損，其具體機(jī)制如何還有待進(jìn)一步研究。

血小板功能PF值主要反映血小板的質(zhì)量，是目前唯一能對(duì)血小板功能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的檢測(cè)，與血小板計(jì)數(shù)相比能更好地反映血小板凝血活性，結(jié)合Sonoclot分析儀的其他指標(biāo)可綜合評(píng)價(jià)患者出凝血狀態(tài)，能夠準(zhǔn)確指導(dǎo)治療[19]。為進(jìn)一步研究重癥中暑對(duì)血小板止血活性的影響，我們檢測(cè)了重癥中暑大鼠血小板功能PF的動(dòng)態(tài)變化。與血小板最大聚集率動(dòng)態(tài)趨勢(shì)一致，我們研究發(fā)現(xiàn)重癥中暑后血小板功能PF值隨復(fù)溫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，原因可能是：在早期，熱打擊引起的炎癥直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，暴露出膠原，釋放血小板活化因子(plateletactivating factor，PAF)使血小板黏附、活化和聚集，在微循環(huán)中形成大量的微血栓，而微血栓形成又會(huì)消耗大量的血小板，此時(shí)血小板功能可能基本正常。隨著病程進(jìn)一步發(fā)展，凝血失控，凝血因子及血小板數(shù)量進(jìn)一步減少，血小板功能障礙[20-21]。

綜上所述，重癥中暑大鼠早期即可發(fā)生血小板數(shù)量減少和功能的下降及活化現(xiàn)象。血小板數(shù)量和功能性病理改變基于何種機(jī)制發(fā)生，同時(shí)是否參與且以何種機(jī)制參與重癥中暑的發(fā)病機(jī)制是下一步的研究重點(diǎn)。

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