熱休克預處理骨髓間充質干細胞對化療性卵巢早衰的療效觀察

陳小瑩，李欣然，王清，汪慶如，付霞霏

隨著化療藥物在惡性腫瘤、自身免疫性疾病中的廣泛應用，相關疾病患者的生存期明顯延長，但同時也使其中的女性患者面臨著化療藥物所致卵巢早衰引起的低雌激素癥狀及不孕等問題[1-2]。近年來，隨著干細胞移植的興起及深入研究，化療性卵巢早衰的治療取得了一定進展。臨床研究表明，干細胞移植能有效治療心肌梗死等損傷性疾病[3]，恢復損傷組織、器官的功能。動物實驗研究也表明，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植能部分恢復化療藥物所致的卵巢損傷[4]。但是干細胞移植的治療效果并沒有達到預期，移植后細胞丟失是其主要原因，如何提高移植細胞的存活率是提高療效的關鍵所在。熱休克預處理作為一種提高細胞抗凋亡能力的有效方法得到深入研究，有文獻報道其可通過上調熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)如HSP27、HSP70的表達來提高細胞的抗凋亡能力[5-6]。本研究建立了化療性卵巢早衰大鼠模型，并對其進行了熱休克預處理后的骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植，檢測移植后大鼠卵巢結構和內分泌功能的變化，以探討熱休克預處理BMSCs在化療性卵巢早衰中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wistar大鼠BMSCs及其完全培養基購自中國廣州賽業生物科技有限公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，Cell Count Kit-8 (CCK-8)試劑盒購自日本Dojindo公司，PBS緩沖液購自美國Hyclone公司，CM-Dil標記液購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗動物 125只近交系SPF級Wistar雌性大鼠(體重180～200g)，另5只4～5周齡雌性Wistar大鼠(體重80～100g)用于分離培養BMSCs，均購自南方醫科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(粵)2011-0074]。

1.3 BMSCs的分離、培養及鑒定 無菌條件下分離大鼠雙側股骨及脛骨，用剪刀從中間剪斷股骨及脛骨，用注射器抽取適量含10%胎牛血清的完全培養液反復沖洗骨髓腔至髓腔變白，用完全培養液調節將所得細胞濃度為約1×109/ml后直接接種于25cm2塑料透氣培養瓶中。將培養瓶放置在37℃、5%CO2培養箱中常規培養，48h后觀察到有少量細胞貼壁后半量更換細胞生長液，以后每2～3d全量更換新鮮培養液，待細胞鋪滿培養瓶約80%時可進行1:2傳代，用0.25%胰酶消化，以5×104/ml細胞濃度傳代擴增。取第3代BMSCs，制成單細胞懸液，采用流式細胞儀對細胞表面標志CD44、CD45、CD29、CD34進行鑒定。選取生長狀態良好的第3代BMSCs進行實驗。

1.4 熱休克預處理BMSCs 細胞貼壁狀態下，將培養瓶用封口膜封口，再用塑料袋密封整個培養瓶。將整個培養瓶置于42℃恒溫水浴箱水浴1h，取下塑料袋及封口膜，更換新鮮培養液，放置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養48h。

1.5 CM-Dil標記熱休克BMSCs BMSCs熱休克處理后48h制成細胞懸液，按最終濃度4μg/ml加入適量1mg/ml的CM-Dil儲存液，37℃培養箱中孵育30min后，1000r/min離心5min，棄去上清液，PBS洗2次。

1.6 動物分組及處理 實驗前對大鼠進行陰道涂片，選取具有正常動情周期的大鼠納入實驗。實驗前剪尾取血1ml，離心后收集血清，于–80℃保存，同批檢測性激素雌二醇(estrogen，E2)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone，FSH)水平，并了解基礎內分泌水平。

大鼠隨機分為5組：正常對照組(不注射藥物)、模型組、假手術組、BMSCs組、熱休克BMSCs組，每組25只。除正常對照組外，其余4組建立化療性卵巢早衰動物模型，建模方案為在給予環磷酰胺首次負荷劑量50mg/kg腹腔注射后，以8mg/(kg·d)的劑量連續腹腔注射14d[7]。在建模結束后第1天，BMSCs組雙側卵巢各注射含有1×l06個BMSCs的20μl細胞懸液，熱休克BMSCs組雙側卵巢各注射含有1×l06個熱休克預處理BMSCs的20μl細胞懸液，假手術組則雙側卵巢各注射20μl生理鹽水。移植時以2%戊巴比妥鈉0.025ml/10g劑量進行腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下開腹直接注射移植至雙側卵巢。

1.7 觀察指標 移植后第1、15、30、45、60天所有大鼠在發情間期采血留取血清，且各組各時間點分批處死大鼠5只，留取卵巢標本。

1.7.1 大鼠陰道涂片觀察動情周期變化 每天早上8:00進行陰道涂片，自然風干后滴加適量亞甲藍染液，經1～2min后用水漂洗，自然干燥后置于顯微鏡下觀察。

1.7.2 血清E2、FSH檢測 用化學發光法檢測血清E2、FSH水平，按試劑盒說明書操作。

1.7.3 卵泡計數 卵巢組織常規進行石蠟包埋，切片(5μm)，取每第12張石蠟切片進行HE染色計算卵泡數。卵泡分類根據以下標準進行：①始基卵泡，含有單層梭形顆粒細胞；②初級卵泡，單層顆粒細胞中至少有3個立方形顆粒細胞；③次級卵泡，至少有兩層顆粒細胞而沒有卵泡腔；④竇卵泡，至少含有兩層顆粒細胞并且有卵泡腔[8]。

1.7.4 顆粒細胞凋亡檢測 用TUNEL法檢測卵巢顆粒細胞凋亡情況，按試劑盒說明書操作。顯微鏡下計數染色的凋亡顆粒細胞個數，至少在8個不同部位計數100個顆粒細胞，計算凋亡顆粒細胞所占比例。

1.8 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行分析。正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義；行×列表計數資料以率表示，多組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，進一步兩兩比較采用χ2分割檢驗，校對后的檢驗水平α=0.0045。

2 結 果

2.1 大鼠動情周期的變化 大鼠正常的動情周期為4～5d，分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期(圖1)。實驗中，正常對照組大鼠動情周期無改變；模型組和假手術組大鼠在實驗中動情周期持續紊亂。細胞移植后16～30d，熱休克BMSCs組與BMSCs組大鼠開始恢復正常動情周期；熱休克BMSCs組恢復正常動情周期的大鼠只數雖多于BMSCs組，但差異無統計學意義(P1-15d=1.0，P16-30d=0.358，P31-45d=0.325，P46-60d=0.5，表1)。

表1 各組各時間點具有正常動情周期的大鼠只數Tab.1 The number of rats having normal estrus cycle in each group at different time points

圖1 大鼠的動情周期 (亞甲藍染色 ×200)Fig.1 Estrus cycle of rat (methylene blue staining ×200)A. Proestrus; B. Oestrus; C. Postestrus; D. Anestrus

2.2 各組大鼠E2、FSH水平變化 各組大鼠基礎E2、FSH水平無明顯差異(FE2=0.671，PE2=0.614；FFSH=1.773，PFSH=0.139)。細胞移植后第1天，與正常對照組比較，其余4組E2水平明顯降低，而FSH則明顯升高，差異有統計學意義(FE2=9.419，PE2=0.000；FFSH=64.122，PFSH=0.000)。但模型組、假手術組、BMSCs組、熱休克BMSCs組間比較，E2、FSH水平差異無統計學意義。此后，模型組和假手術組E2水平持續下降，FSH水平持續上升。細胞移植后15d，熱休克BMSCs組與BMSCs組大鼠的E2水平開始明顯高于模型組與假手術組(P＜0.05)，但兩組間比較差異無統計學意義。細胞移植后15d，熱休克BMSCs組及BMSCs組大鼠FSH明顯低于模型組及假手術組(P＜0.05)，但隨后BMSC組FSH水平轉而呈緩慢上升趨勢。移植第30、45、60天，熱休克MSC組E2水平明顯高于BMSC組(P＜0.05)，但仍低于正常對照組(P＜0.05)；而FSH水平則明顯低于BMSC組(P＜0.05)，卻高于正常對照組(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠E2 (A)及FSH(B)的變化曲線Fig.2 The curve of E2 (A) and FSH (B) in each group of rats

2.3 各組大鼠卵巢各級卵泡計數情況 細胞移植后第1天及第15天，模型組、假手術組、BMSCs組、熱休克BMSCs組各級卵泡數均明顯少于正常對照組(FD1，始基卵泡=3.491，PD1，始基卵泡=0.026；FD1，初級卵泡=4.367，PD1，初級卵泡=0.011；FD1，次級卵泡=3.065，PD1，次級卵泡=0.040；FD1，竇卵泡=4.039，PD1，竇卵泡=0.015；FD15，始基卵泡=9.147，PD15，始基卵泡=0.000；FD15，初級卵泡=13.088，PD15，初級卵泡=0.000；FD15，次級卵泡=6.657，PD15，次級卵泡=0.001；FD15，竇卵泡=13.423，PD15，竇卵泡=0.000)，但模型組、假手術組、BMSCs組、熱休克BMSCs組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。細胞移植第30天，BMSCs組和熱休克BMSCs組大鼠各級卵泡數較前無明顯減少，而模型組及假手術組各級卵泡數仍繼續減少，但4組間各級卵泡數差異無統計學意義(P＞0.05)。細胞移植第45天及第60天，BMSCs組和熱休克BMSCs組大鼠各級卵泡數均明顯高于模型組及假手術組(P＜0.05)，且熱休克BMSCs組大鼠各級卵泡數均高于BMSCs組，差異有統計學意義(P＜0.05)，但仍明顯低于正常對照組(P＜0.05，圖3)。2.4 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況 細胞移植后第1天，模型組、假手術組、BMSCs組、熱休克BMSCs組的卵巢顆粒細胞凋亡指數均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(F=43.574，P=0.000)，但模型組、假手術組、BMSCs組、熱休克BMSCs組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。細胞移植第15、30、45、60天，BMSCs組和熱休克BMSCs組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡指數均較細胞移植后第1天明顯降低，且明顯低于模型組及假手術組(P＜0.05)；而熱休克BMSCs組顆粒細胞凋亡指數低于BMSCs組(P＜0.05)，但仍高于正常對照組(P＜0.05，圖4)。

圖3 各組大鼠不同時間點的各級卵泡數Fig.3 The amount of primordial follicles (A), primary follicles (B), secondary follicles (C) and antral follicles (D) in each group of rats at different time points

圖4 細胞移植后第1(A)、60天(B)各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡指數Fig.4 Apoptotic index of ovarian granulosa cells in each group of rats at the first day (A) and sixty days (B) after cell transplantation

3 討 論

自化療藥物應用于臨床治療以來，在為腫瘤及免疫性疾病患者帶來希望的同時，也給其中的女性患者帶來了嚴重的遠期危害?；熜月殉苍缢セ颊叩牡痛萍に匕Y狀嚴重影響了其生活質量，而卵巢早衰帶來的不孕問題更是對年輕女性及其家庭造成了嚴重影響[9]。目前化療性卵巢早衰的治療方法包括激素補充治療[10]、卵巢冷凍移植[11]、卵子捐贈體外受精-胚胎移植等，但這些方法均有其局限性：激素補充治療能緩解患者的圍絕經期癥狀，但并不能從根本上進行治療；卵巢冷凍移植技術目前尚未成熟，仍有待進一步研究；卵子捐贈則存在倫理學問題。

目前已有多個研究顯示干細胞移植可改善化療藥物所致的卵巢功能受損[4,12]，但移植后細胞存活率低，嚴重影響了其治療效果。研究顯示，干細胞移植后的存活率僅10%～20%，而其凋亡、壞死多發生于移植后的4d內[13]。因此，如何提高移植干細胞的存活力并保持其生物學活性成為目前亟須解決的問題，是當今干細胞研究領域的熱點。

1962 年Ritossa[14]最早發現熱休克反應的存在，他觀察到在環境溫度升高時果蠅染色體發生蓬松現象，并具有轉錄活性。隨后1974年Tissieres等[15]證實Ritossa當時所猜測的這種物質是一組特殊蛋白質，并把這組蛋白質命名為HSP。進一步體外實驗研究發現熱休克處理可提高移植細胞的抗凋亡能力，Feng等[16]證實熱休克處理的BMSCs移植后存活率明顯提高，從而能更有效地改善心臟功能及減少小鼠缺血心肌的纖維化。因此，熱休克可作為細胞移植前一種較為理想的預處理方法。

本實驗對BMSCs進行熱休克預處理，用于治療大鼠化療性卵巢早衰。陰道涂片結果顯示，熱休克BMSCs組在細胞移植后16～30d即有大鼠恢復正常動情期，但大鼠動情周期恢復率與BMSCs組相比差異無統計學意義。血清E2及FSH檢測結果顯示細胞移植30d后，熱休克BMSCs組大鼠E2水平逐漸升高，且與BMSCs組相比升高更為明顯，而FSH則明顯下降。卵泡計數結果顯示細胞移植第45天后，熱休克BMSCs組大鼠各級卵泡數均多于BMSCs組。上述結果表明，BMSCs經熱休克預處理后能更好地改善化療所致的受損卵巢的內分泌功能，并具有更強大的減少卵泡閉鎖、修復損傷卵巢結構的效果。同時，本實驗發現，熱休克BMSCs組與BMSCs組相比卵巢顆粒細胞凋亡減少更明顯，這提示熱休克預處理BMSCs通過減少卵巢顆粒細胞的凋亡從而發揮修復損傷卵巢的作用。

HSP作為分子伴侶在應激狀態下具有重要作用，能在應激狀態下幫助蛋白質正確折疊，加快正常蛋白質合成的恢復[17]。研究表明，BMSCs經過一定程度的熱休克處理能在一定時間內持續高表達HSP，如HSP27、70、90等[5,16,18]。這提示熱休克處理的細胞可通過高表達HSP而提高抗凋亡能力。且HSP能在細胞受到短暫刺激后長時間持續表達，幫助細胞度過移植后的凋亡高峰，從而增加移植細胞的存活率，提高細胞移植的治療效果。此外，干細胞能夠通過外泌體分泌具有生物活性的細胞因子或蛋白質，從而改變宿主細胞的生物學特性[19]。而有研究證實，干細胞經熱休克預處理后能旁分泌富含熱休克轉錄因子1的囊泡，從而重塑宿主細胞的相關染色體[16]。這也是經熱休克處理的干細胞能更好地修復受損組織的可能機制之一。

綜上所述，本研究表明BMSCs經熱休克處理后能減少卵巢顆粒細胞的凋亡，減輕卵泡閉鎖，增加各級卵泡數量，改善激素水平，對化療藥物誘導的卵巢結構及功能損傷具有更顯著的修復作用，為今后臨床應用BMSCs移植治療卵巢早衰提供了一種有效的移植前處理方法。但熱休克處理對細胞的保護作用機制可能是多方面的，仍有待進一步深入研究。

[1]Blumenfeld Z. Chemotherapy and fertility[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2012, 26(3): 379-390.

[2]Li XR, He YL, Wang XF, et al. Therapeutic effect of lentivirusmediated miR-21 on chemotherapy-induced premature ovarian failure in rats[J]. Med J Chin PLA, 2017, 42(9): 759-763. [李欣然, 何援利, 王雪峰, 等. 慢病毒介導的miR-21對化療所致大鼠卵巢早衰的治療作用[J]. 解放軍醫學雜志, 2017, 42(9):759-763.]

[3]Mathiasen AB, Qayyum AA, Jorgensen E, et al. Bone marrowderived mesenchymal stromal cell treatment in patients with severe ischaemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (MSC-HF trial)[J]. Eur Heart J, 2015, 36(27): 1744-1753.

[4]Fu X, He Y, Xie C, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves ovarian function and structure in rats with chemotherapy-induced ovarian damage[J]. Cytotherapy,2008, 10(4): 353-363.

[5]Moloney TC, Hoban DB, Barry FP, et al. Kinetics of thermally induced heat shock protein 27 and 70 expression by bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Protein Sci, 2012,21(6): 904-909.

[6]Geng Y, Peng N, Tong HS, et al. Protective effects of heat shock protein 70 on the acute lung injury of rats with heat stroke and its mechanism[J]. Med J Chin PLA, 2017, 42(4): 295-300. [耿焱, 彭娜, 童華生, 等. 熱休克蛋白70對中暑大鼠急性肺損傷的保護作用及機制研究[J]. 解放軍醫學雜志, 2017, 42(4):295-300.]

[7]Fu X, He Y, Wang X, et al. Overexpression of miR-21 in stem cells improves ovarian structure and function in rats with chemotherapy-induced ovarian damage by targeting PDCD4 and PTEN to inhibit granulosa cell apoptosis[J]. Stem Cell Res Ther, 2017, 8(1): 187.

[8]Devine PJ, Sipes IG, Hoyer PB. Initiation of delayed ovotoxicity by in vitro and in vivo exposures of rat ovaries to 4-vinylcyclohexene diepoxide[J]. Reprod Toxicol, 2004, 19(1):71-77.

[9]Turan V, Oktay K. Sexual and fertility adverse effects associated with chemotherapy treatment in women[J]. Expert Opin Drug Saf, 2014, 13(6): 775-783.

[10]Gelbaya T, Vitthala S, Nardo L, et al. Optimizing hormone therapy for future reproductive performance in women with premature ovarian failure[J]. Gynecol Endocrinol, 2011, 27(1):1-7.

[11]Donnez J, Dolmans MM. Fertility preservation in women[J].Nat Rev Endocrinol, 2013, 9(12): 735-749.

[12]Kilic S, Pinarli F, Ozogul C, et al. Protection from cyclophosphamide-induced ovarian damage with bone marrowderived mesenchymal stem cells during puberty[J]. Gynecol Endocrinol, 2014, 30(2): 135-140.

[13]Zhang M, Methot D, Poppa V, et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies[J]. J Mol Cell Cardiol, 2001, 33(5): 907-921.

[14]Ritossa F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in drosophila[J]. Experientia, 1962, 18(12): 571-573.

[15]Tissieres A, Mitchell HK, Tracy UM. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs[J]. J Mol Biol, 1974, 84(3): 389-398.

[16]Feng Y, Huang W, Meng W, et al. Heat shock improves Sca-1+stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway[J]. Stem Cells, 2014, 32(2):462-472.

[17]Morrow G, Hightower LE, Tanguay RM. Small heat shock proteins: big folding machines[J]. Cell Stress Chaperones, 2015,20(2): 207-212.

[18]Qiao PF, Yao L, Zhang XC, et al. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(45): 12822-12834.

[19]Bruno S, Camussi G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair[J]. Pediatr Nephrol, 2013, 28(12):2249-2254.