糖基化終產物對P38MAPK/NF-κB通路誘導的腸道L細胞損傷的影響

周文君，張振，許寧寧，李雙喜，陳宏

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由腸道L細胞分泌的腸促胰素，可作用于胰島β細胞，促進細胞增殖并抑制其凋亡，促進胰島素的釋放并明顯改善胰島細胞的功能[1-2]。此外，在脂肪細胞中，GLP-1受體激活劑可改善其對胰島素敏感性，并抑制其增殖[3]。腸促胰島素效應的減弱可導致胰島β細胞功能障礙和胰島素抵抗[4]，最終將發展成2型糖尿病，而腸道L細胞的早期炎癥損傷可能是GLP-1分泌減少的關鍵原因[5]。因此，探討腸道L細胞早期炎癥損傷的發生機制對糖尿病的防治研究具有重要意義。晚期糖基化的過程導致糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)積累，加速了糖尿病、腎衰竭、炎癥、神經病變和衰老的進程[6-7]。AGEs作用于糖基化終產物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)可導致NADPH積累，最終導致核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路的激活，在誘導細胞因子和炎癥介質表達的過程中起到關鍵作用，加劇了糖尿病糖耐量受損階段的病理改變。而p38MAPK作為NF-κB的重要上游激酶，可被氧化產物激活后誘導NF-κB的活化[8]。2型糖尿病長期的慢性低度炎癥可能是腸道L細胞發生早期炎癥損傷并導致腸促胰島素分泌減少的關鍵原因，與AGEs/RAGE/NADPH/p38MAPK/NF-κB信號通路密切相關。但是，上述通路在腸道L細胞炎癥損傷中的作用尚未見報道。本研究旨在探討AGEs在p38MAPK/NF-κB信號通路誘導的腸道L細胞早期損傷中的作用及機制，以期為研究2型糖尿病的發生發展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 腸道L細胞株由加拿大多倫多大學Druker實驗室的Drucker DJ教授惠贈。10%胎牛血清、DMEM低糖培養基(美國Hyclone公司)，兔抗鼠NF-κB p65抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體(碧云天公司)，兔抗鼠phospho-p38MAPK抗體(美國Santa Cruz公司)，HRP標記的羊抗兔IgG抗體(美國R&D公司)，HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(美國R&D公司)，GLP-1、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(美國Sigma公司)，Trizol SYBR及反轉錄試劑盒(日本TAKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 將腸道L細胞按文獻[9]的方式進行培養，待細胞進入對數生長期后，消化傳代。將胎牛血清白蛋白(BSA)和D-葡萄糖溶于PBS中，避光孵育12周制備AGEs-BSA。以熒光分光光度計鑒定AGEs-BSA。采用24孔板鋪板細胞，用DMEM低糖培養基預處理，在37℃、5% CO2培養箱中培養6h，使其處于同步化狀態，每24h換液。實驗分為6組：空白對照組(NC組，即不加入干預因素，僅培養于DMEM低糖培養基中)、BSA對照組(即培養于加入BSA的DMEM低糖培養基中)、AGEs 100μg/ml組(培養于含100μg/ml AGEs的DMEM低糖培養基中)、AGEs 200μg/ml組(培養于含200μg/ml AGEs的DMEM低糖培養基中)、AGEs 300μg/ml組(培養于含300μg/ml AGEs的DMEM低糖培養基中)、AGEs+apocynin組(培養于含200μg/ml AGEs和600μmol/L apocynin的DMEM低糖培養基中[9])，干預方法同前。各組細胞在37℃、5%CO2條件下培養24h后進行各項指標檢測。

1.2.2 GLP-1分泌水平檢測 采用ELISA法進行檢測，其可測范圍為4.1～1000pmol/L，批內和批間變異系數分別為5%和12%。按ELISA試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上測定波長450nm處的吸光度(OD)值和樣本濃度。

1.2.3 p38MAPK、NF-κB p65 mRA水平檢測 采用RT-PCR進行檢測。使用Trizol試劑從β細胞提取總RNA，再用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。采用2–ΔΔCt法檢測p38MAPK、NF-κB p65的相對基因表達水平。

1.2.4 p-p38MAPK、p38MAPK、NF-κB p65蛋白表達水平檢測 采用Western blotting法進行檢測。提取細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，8% SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜。7.5%脫脂牛奶封閉2h，分別加入特異性一抗phospho-p38MAPK(1:1000)、NF-κB p65(1:1000)和內參β-actin(1:10 000)4℃孵育過夜。洗膜，加入二抗(1:1000羊抗兔IgG抗體)孵育1h，洗膜，采用Bio-Rad凝膠掃描成像系統顯影拍照，Quantity One圖像軟件分析目的蛋白和內參蛋白的灰度值，計算相對灰度值。

1.2.5 炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6水平的檢測采用ELISA法進行檢測。TNF-α的可測范圍為50～2450pg/ml，批內和批間變異系數分別為5%和12%；IL-1的可測范圍為0.01～1000pg/ml，批內和批間變異系數分別為5%和12%。IL-6的可測范圍為0.01～100pg/ml，批內和批間變異系數分別為5%和12%。按ELISA試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上測定450nm波長處的OD值和樣本濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組GLP-1分泌水平的比較 與NC組(92.30±5.10pmol/L)、BSA組(87.75±7.10pmol/L)相比，不同濃度(100、200、300μg/ml)AGEs處理組的GLP-1分泌水平(分別為70.03±4.32、55.28±6.25、38.15±6.10pmol/L)均明顯下降(P＜0.05)，且呈濃度依賴性(P＜0.05)，采用apocynin抑制NADPH酶的活性后，AGEs+apocynin組GLP-1分泌水平(83.60±7.28pmol/L)較AGEs組明顯上升(P＜0.05)。

2.2 各組p38MAPK、NF-κB p65 mRNA的表達水平比較 與NC、BSA組相比，隨著AGEs濃度的升高，AGEs處理組p38MAPK、NF-κB p65 mRNA有升高的趨勢，并與AGEs濃度呈正相關，在200μg/ml和300μg/ml AGEs處理組中的差異有統計學意義(P＜0.05)。NADPH酶抑制劑apocynin干預明顯抑制了AGEs對p38MAPK、NF-κB p65 mRNA的上調作用，即p38MAPK、NF-κB p65 mRNA水平明顯降低(P＜0.05，圖1)。

圖1 AGEs對p38MAPK、NF-κB p65 mRNA水平的調控Fig.1 Effect of AGEs on the level of p38MAPK, NF-κB p65 mRNA

2.3 AGEs對p38MAPK、p-P38MAPK、NF-κB p65蛋白表達的影響 各組p38MAPK蛋白表達水平差異無統計學意義，但p38MAPK蛋白磷酸化(p-p38MAPK)和NF-κB p65蛋白表達差異有統計學意義(Fp-p38MAPK=101.600，FNF-κB=46.666，P=0.000)。其中，各濃度AGEs組p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白表達水平較NC組、BSA組明顯升高(P＜0.05)，且呈濃度依賴性，表明隨著AGEs濃度的上升，p38MAPK磷酸化水平升高(P＜0.05)。而用apocynin抑制NADPH酶的活性后，與AGEs組比較，AGEs+apocynin組p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05，圖2)。

2.4 AGEs對TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平的影響

與NC組、BSA組比較，AGEs各濃度組炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平均上升(P＜0.05)，呈濃度依賴性，表明AGEs的促炎癥作用與其濃度相關。而用apocynin抑制NADPH酶的活性后，TNF-α、IL-1、IL-6表達水平較AGEs組明顯下降(P＜0.05，表1)。

3 討 論

AGEs與RAGE結合可引起氧化應激并激活多條細胞信號轉導通路，誘發一系列促炎、促凝血反應，促進糖尿病并發癥如動脈粥樣硬化、腎臟病變的發生與發展[10-11]。本研究前期實驗證實，AGEs作用于腸道L細胞，可上調細胞RAGE表達，從而激活NADPH氧化酶，使細胞內ROS生成增多，誘導腸道L細胞的凋亡。此外，AGEs與RAGE結合后不僅導致細胞凋亡，還可誘發炎癥反應，現許多研究表明，AGEs可促進炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的分泌，從而損傷細胞，但AGEs的促炎癥作用對腸道L細胞的影響尚未見報道[12-13]。GLP-1是腸道L細胞受消化食物刺激后分泌的一種腸促胰素，能夠抑制食物的攝取，促進胃排空，改善胰島素的敏感性，還可作用于α、β細胞，產生雙向調節作用。GLP-1受體激動劑以及GLP-1類似物目前已廣泛應用于治療2型糖尿病，成為近年來糖尿病防治領域的重要進展[14]。目前動物研究表明，GLP-1可明顯改善胰島β細胞的功能，促進β細胞增殖并抑制其凋亡[15]。本研究結果顯示，隨著AGEs濃度的升高，腸道L細胞TNF-α、IL-1、IL-6表達水平升高，即說明了AGEs的促炎癥作用。而隨著環境中炎癥因子水平的上升，又直接影響了腸道L細胞的分泌功能，最終導致細胞GLP-1分泌水平下降。采用apocynin抑制NADPH酶活性后，TNF-α、IL-1、IL-6表達水平明顯下降，且GLP-1分泌水平恢復，提示AGEs可誘導腸道L細胞產生炎癥損傷，且該作用與NADPH酶的激活有關。

圖2 AGEs對p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.2 Effect of AGEs on the protein expression of p38MAPK, p-p38MAPK and NF-κB p65

表1 AGEs對TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平的影響(pg/ml，±s)Tab.1 Effect of AGEs on the secretion of TNF-α、IL-1、IL-6 (pg/ml, ±s)

表1 AGEs對TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平的影響(pg/ml，±s)Tab.1 Effect of AGEs on the secretion of TNF-α、IL-1、IL-6 (pg/ml, ±s)

APO. Apocynin; (1)P＜0.05 compared with NC group and BSA group; (2)P＜0.05 compared with 100μg/ml AGEs group; (3)P＜0.05 compared with 200μg/ml AGEs group; (4)P＜0.05 compared with 300μg/ml AGEs group

Group TNF-α IL-1 IL-6 NC 15.30±1.71 50.67±4.99 43.80±5.94 BSA 16.10±2.15 55.33±6.06 50.40±5.64 100μg/ml AGEs 27.23±4.25(1) 136.50±13.05(1) 95.93±12.29(1)200μg/ml AGEs 38.93±3.62(1)(2) 197.17±12.01(1)(2) 177.93±9.26(1)(2)300μg/ml AGEs 54.47±5.85(1)(2)(3) 287.70±13.75(1)(2)(3) 234.27±19.74(1)(2)(3)AGEs+apocynin 18.40±3.75(2)(3)(4) 68.17±8.72(2)(3)(4) 63.50±7.62(2)(3)(4)

NF-κB作為一種主要的轉錄因子，可以結合在免疫球蛋白輕鏈基因增強子上的B細胞特異核蛋白，存在于不同類型細胞中且控制多種基因的表達，這些基因的增強子中均含有NF-κB結合位點，激活的NF-κB能啟動這些靶基因的轉錄，在炎癥和自身免疫反應中起重要作用[4,16]。一般情況下，非活化的NF-κB復合物位于細胞質中，該復合物包括功能性亞基p65和抑制性亞基IκBα。功能性亞基可以直接與DNA結合，從而進一步引起基因的轉錄調控，而抑制性亞基IκBα則可阻止功能性亞基的分離。在應激反應中，IκB激酶(IKK)使抑制型亞基IκBα降解，最終導致功能性亞基p65釋放，并向細胞核轉移，與DNA結合后引起基因轉錄調控[17]。p38MAPK是NF-κB的上游激酶，p38MAPK的激活能進一步誘導NF-κB活化，在NF-κB通路的激活中起著重要的作用。Nick等[18]證實LPS刺激中性粒細胞可激活p38MAPK磷酸化，最終調節細胞間黏附及NF-κB活化，并增強TNF-α mRNA及蛋白的表達，提示p38MAPK對NF-κB具有正向調控作用。

有研究表明，血管內皮NADPH氧化酶亞單位Nox-4過度表達，與p22phox一起構成活化的復合物，誘導內皮細胞產生超氧陰離子，并使p38MAPK磷酸化[19]。Sun等[20]研究發現，AGEs可通過RAGE/p38MAPK/NF-κB途徑引起人內皮祖細胞功能紊亂，進而促進動脈粥樣硬化的形成。Yeh等[21]對人單核細胞的研究表明，AGEs和RAGE結合引起p38MAPK磷酸化，導致NF-κB通路活化，促進炎癥因子TNF-α、IL-1、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達和釋放，該機制在糖尿病血管并發癥的發生、發展中起著重要作用。這提示我們上述AGEs通路的促炎癥作用也可能參與腸道L細胞的炎癥發生過程，然而目前尚未有研究明確報道。本研究結果提示，隨著AGEs處理濃度的提高，p38MAPK磷酸化水平和NF-κB表達量呈劑量依賴性增加，表明NF-κB通路被激活，而用apocynin特異性抑制NADPH氧化酶的活性后，細胞內p38MAPK磷酸化和NF-κB表達量水平下降，說明AGEs與RAGE結合后激活了NADPH氧化酶，繼而激活p38MAPK/NF-κB通路，誘導腸道L細胞的炎癥損傷，符合之前的研究猜想。

綜上所述，本研究發現，AGEs作用于腸道L細胞，與RAGE結合后激活NADPH氧化酶，進而通過p38MAPK/NF-κB途徑促進TNF-α、IL-1、IL-6的分泌，使L細胞出現炎癥損傷，最終導致GLP-1分泌減少。用apocynin抑制NADPH氧化酶后可減輕AGEs對腸道L細胞的炎癥損傷作用，GLP-1分泌可以得到一定程度的恢復。本研究為減輕腸道L細胞的炎癥反應以及提高GLP-1分泌水平，從而改善2型糖尿病的發生發展提供了新的思路，為apocynin的應用提供了研究基礎，但L細胞的炎癥作用于p38MAPK/NF-κB通路的相關機制尚需進一步探索。

[1]Yang L, Yao D, Yang H, et al. Puerarin protects pancreatic β-cells in obese diabetic mice via activation of GLP-1R signaling[J].Mol Endocrinol, 2016, 30(3): 361-371.

[2]Miao XY, Gu ZY, Liu P, et al. The human glucagon-like peptide-1 analogue liraglutide regulates pancreatic beta-cell proliferation and apoptosis via an AMPK/mTOR/P70S6K signaling pathway[J]. Peptides, 2013, 39: 71-79.

[3]Li Y, Du J, Zhu E, et al. Liraglutide suppresses proliferation and induces adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells via the Hippo-YAP signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2018, 17(3): 4499-4507.

[4]Haslbeck KM, Schleicher E, Bierhaus A, et al. The AGE/RAGE/NF-(kappa)B pathway may contribute to the pathogenesis of polyneuropathy in impaired glucose tolerance (IGT)[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2005, 113(5): 288-291.

[5]Guglielmi V, Sbraccia P. GLP-1 receptor independent pathways:emerging beneficial effects of GLP-1 breakdown products[J].Eat Weight Disord, 2016, 22(2): 231-240.

[6]Kay AM, Simpson CL, Stewart JA Jr. The role of AGE/RAGE signaling in diabetes-mediated vascular calcification[J]. J Diabetes Res, 2016, 2016: 6809703.

[7]Lu SS, Li XD, Luo SD, et al. Implications of newly-added N-glycosylation mutation of hepatitis B virus S-gene in patients with coexistence of HBsAg and antiHBs[J]. Med J Chin PLA,2016, 41(5): 351-357. [盧姍姍, 李曉東, 羅聲棟, 等. HBsAg和抗HBs雙陽性患者S基因新增N-糖基化突變的意義[J]. 解放軍醫學雜志, 2016, 41(5): 351-357.]

[8]Senatus LM, Schmidt AM. The AGE-RAGE Axis: implications for age-associated arterial diseases[J]. Front Genet, 2017, 8: 187.

[9]Hu YH, Zhang Z, Lei L, et al. Advanced glycation end products and its receptor induce apoptosis of L cells through NADPH oxidase mediated signaling pathway[J]. J Pract Med, 2017,33(3): 358-362. [胡穎輝, 張振, 雷蕾, 等. 糖基化終產物通過其受體激活NADPH氧化酶及其下游通路誘導L細胞的凋亡[J]. 實用醫學雜志, 2017, 33(3): 358-362.]

[10]Wang XL, Yu T, Yan QC, et al. AGEs promote oxidative stress and induce apoptosis in retinal pigmented epithelium cells RAGE-dependently[J]. J Mol Neurosci, 2015, 56(2): 449-460.

[11]Yamagishi S, Takeuchi M, Inagaki Y, et al. Role of advanced glycation end products (AGEs) and their receptor (RAGE) in the pathogenesis of diabetic microangiopathy[J]. J Int Med Res,2003, 23(4): 129-134.

[12]You J, Zhu ML, Peng W, et al. Advanced glycation endproducts induce the expression of TNF-α through RAGE in Jurkat cells[J]. Chin J Immun, 2012, 28(7): 594-598. [游捷, 朱明理,彭偉, 等. AGEs通過RAGE促進Jurkat細胞分泌腫瘤壞死因子-α[J]. 中國免疫學雜志, 2012, 28(7): 594-598.]

[13]Yanagida M, Jung G, Tanaka Y, et al. Serum proteome analysis in patients with rheumatoid arthritis receiving therapy with etanercept, a chimeric tumor necrosis factor-alpha receptor[J].Int J Rheum Dis, 2012, 15(5): 486-495.

[14]Bastien-Dionne PO, Valenti L, Kon N, et al. Glucagon-like peptide 1 inhibits the sirtuin deacetylase SirT1 to stimulate pancreatic β-cell mass expansion[J]. Diabetes, 2011, 60(12): 3217-3222.

[15]Lee YA, Wang MY, Du XQ, et al. Glucagon receptor knockout prevents insulin-deficient type 1 diabetes in mice[J]. Diabetes,2011, 60(2): 391-397.

[16]Mao X, Su Z, Mookhtiar AK. Long non-coding RNA: a versatile regulator of the nuclear factor -κB signaling circuit[J].Immunology, 2016, 150(4): 379-388.

[17]Gilmore TD. Introduction to NF-kappaB: players, pathways,perspectives[J]. Oncogene, 2006, 25(51): 6680-6684.

[18]Nick JA, Avdi NJ, Young SK, et al. Selective activation and functional significance of p38alpha mitogen-activated protein kinase in lipopolysaccharide-stimulated neutrophils[J]. J Clin Invest, 1999, 103(6): 851-858.

[19]Goettsch C, Goettsch W, G, Seebach J, et al. Nox4 overexpression activates reactive oxygen species and p38 MAPK in human endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009,380(2): 355-360.

[20]Sun C, Liang C, Ren Y, et al. Advanced glycation end products depress function of endothelial progenitor cells via p38 and ERK 1/2 mitogen-activated protein kinase pathways[J]. Basic Res Cardiol, 2009, 104(1): 42-49.

[21]Yeh CH, Sturgis L, Haidacher J, et al. Requirement for p38 and p44/p42 mitogen-activated protein kinases in RAGE-mediated nuclear factor-κB transcriptional activation and cytokine secretion[J]. Diabetes, 2001, 50(6): 1495-1504.