創傷弧菌溶細胞素對小鼠骨髓來源巨噬細胞壞死性凋亡的作用及機制

帥維正，劉劍飛，吳成林，劉妍，蒲倩，王欲曉，周麗君，張志成，段蘊鈾

創傷弧菌(Vibrio vulnificus)是我國沿海常見的致病性海洋弧菌，通常以經消化道感染多見，但也可通過傷口沾染后致病，如海上作業和訓練時破損的皮膚黏膜接觸含菌海水即可發生嚴重感染[1-2]。創傷弧菌感染機體后除導致局部癥狀和損傷外，膿毒癥是其造成的嚴重后果之一[3]，文獻提示一旦發生創傷弧菌感染所致膿毒癥，病死率可超過50%[4]。創傷弧菌的主要致病因子包括溶細胞素、金屬蛋白酶、軟骨素酶、透明質酸酶等細胞外產物[5]，其中針對創傷弧菌溶細胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVc)的研究較多，VVc可對不同細胞產生致傷致死作用，導致細胞溶解、凋亡等。目前的研究多集中在VVc所致細胞凋亡的機制等方面，但凋亡作為非炎癥性的細胞死亡方式，不能解釋創傷弧菌引起的劇烈炎癥反應，尤其是膿毒癥休克。壞死性凋亡(necroptosis)是新近發現的一種可調節炎癥性細胞壞死方式，其在具有程序性死亡特性的同時，還具有可以引起并擴大炎癥反應的特點。近年來研究顯示壞死性凋亡在許多人類疾病中起重要作用，而壞死性凋亡是否在創傷弧菌的致病過程中發揮作用，目前尚無報道。本研究探討VVc在永生化小鼠骨髓來源的巨噬細胞(immortalized bone marrow-derived macrophage，iBMDM)壞死性凋亡中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 iBMDM由邵峰院士惠贈，DMEM培養液及磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購買于美國Gibco公司，CytoTox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自德國美天旎公司，caspase1、caspase11抗體購自圣克魯斯生物技術有限公司，GSDMD(gasdermin D protein)、混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)、磷酸化MLKL(pMLKL)抗體購自美國Abcam公司。受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)抑制劑necrostatin-1(Nec-1)購自美國Sigma公司。

1.2 VVc蛋白制備 使用本單位前期制備的VVc蛋白， 根據GenBank中公布的VVc(GenBank=NC_005140.1)序列設計擴增目的基因引物。Pvvf1：5'-GCGGATC CATGAAAAAAATGACTCTGTTT-3'(BamH Ⅰ)；Pvvr2：5'-CCCTCGAGGAGTTTGACTTGTTGTAAT GT-3'(Xho Ⅰ)，由上海生工進行基因的克隆與鑒定，并構建原核表達質粒，獲得在大腸埃希菌中的高效表達并行SDSPAGE鑒定，將純化VVc蛋白置于–70℃保存備用[6]。

1.3 乳酸脫氫酶(LDH)檢測評價細胞毒性 按不同濃度梯度(1、2、4μg/ml)VVc刺激iBMDM，采用細胞毒性檢測試劑盒測定細胞上清LDH水平。具體方法為：將50μl待測細胞上清轉移至96孔酶分析板中，每孔均加入50μl底物，用鋁箔紙覆蓋，室溫孵育30min；加入50μl終止液，檢測490nm波長處吸光度(OD)值。死亡率(%)=(實驗組OD值－陰性組OD值)/(陽性組OD值－陰性組OD值)×100%。

1.4 細胞培養及分組 根據上述結果將iBMDM分為5組：對照組、VVc 2μg/ml組、VVc 2μg/ml+Nec-1 5μmol/L組、VVc 4μg/ml組和VVc 4μg/ml+Nec-1 5μmol/L。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，加入青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)，置于5% CO2、37℃、恒溫、恒濕的培養箱中進行培養。VVc組以相應濃度VVc刺激iBMDM細胞，RIP1抑制劑組在VVc處理前1h加入5μmol/L的Nec-1，2h后收集細胞和培養基上清。

1.5 流式細胞儀檢測iBMDM凋亡情況 采用流式細胞檢測試劑盒測定細胞狀態。具體方法為：收集待測細胞，加入1ml結合緩沖液漂洗細胞，300×g離心10min，棄上清；加入100～150μl結合緩沖液重懸細胞，加入10μl annexin V，混勻避光室溫孵育15min；再加入1ml結合緩沖液，300×g離心10min，棄上清；加入500μl結合緩沖液重懸；加入5μl PI，上機檢測。

1.6 Western blotting檢測焦亡與壞死性凋亡相關蛋白的表達 收集各實驗孔細胞，提取蛋白，行12% SDS-PAGE凝膠電泳；采用濕轉方法，將蛋白轉印至0.2μm孔徑的PVDF膜上：將轉印好的PVDF膜在TBST配制的5%BSA中室溫封閉3h，TBST洗膜3次，每次5min；加入一抗[MLKL(1:1000)，pMLKL(1:1000)，Actin(1:10 000)]4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5min；加入TBST配制的5%BSA，再加入二抗(均為HRP標記山羊抗兔抗體1:10 000)室溫水平搖床孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min。采用化學發光劑ECL顯色，GE化學發光成像系統進行圖像采集，采用Image J軟件對灰度值進行分析。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LDH法評價VVc對iBMDM細胞的毒性情況采用1、2、4μg/ml不同濃度VVc刺激iBMDM細胞2h，如圖1所示，LDH水平隨VVc濃度升高而上調，提示細胞死亡率增加，其中4μg/ml濃度處理后LDH明顯上升，而2μg/ml濃度次之；加入Nec-1預處理后，細胞上清LDH水平明顯降低(P＜0.05)。

2.2 流式細胞儀檢測iBMDM凋亡情況 流式細胞儀檢測結果顯示，iBMDM接受VVc處理后，Annexin V/PI雙染色陽性細胞比例增加，使用Nec-1預處理后，雙陽性染色細胞的比例下降(P＜0.05，圖2)。

圖1 LDH法評價VVc處理對iBMDM細胞的毒性(n=3)Fig.1 Analysis of LDH levels in supernatant of iBMDM cells following the VVc challenge (n=3)

圖2 流式細胞術檢測iBMDM凋亡情況Fig.2 Effect of VVc on iBMDM cells (Flow cytometry)

2.3 Western blotting檢測焦亡與壞死性凋亡相關蛋白的表達 Western blotting檢測結果顯示，iBMDM在接受VVc刺激后，存在磷酸化MLKL(pMLKL/MLKL)表達上調，而這一磷酸化過程可被Nec-1預處理所抑制(P＜0.05，圖3A)。VVc刺激后，caspase1、caspase11以及GSDMD等凋亡相關蛋白表達量有所變化，但均未見其活化剪切體表達(圖3B)。

3 討 論

VVc是具有創傷弧菌種屬特征性的外毒素，是創傷弧菌感染的重要致病因子[7]。研究表明，VVc通過誘導產生超氧陰離子，介導鈣離子內流以及刺激合成一氧化氮合酶(NOS)等方式啟動細胞凋亡信號通路的活化[8-10]。此外，也有報道提示VVc可通過誘導巨噬細胞TNF-α和IL-6表達，上調機體炎癥反應水平[11]，但是否會導致炎癥性細胞程序性死亡則未見明確報道。

壞死性凋亡和焦亡均屬于程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)，目前認為GSDMD和MLKL是焦亡和壞死性凋亡的最終執行蛋白，當其轉化為激活狀態時標志著各自細胞程序性死亡的發生[12]。雖然同屬PCD，但兩者也有著明顯的差異。首先，調控途徑不同，在壞死性凋亡發生的過程中，MLKL由于受到壞死復合物(necrosome)關鍵組分中RIP1和RIP3的調控而出現磷酸化，進而發生寡聚化并轉位于細胞膜上，激活相關離子通道。而在焦亡的進程中，炎癥型半胱氨酸天冬酶caspase-1和caspase-11通過剪切GSDMD蛋白使其產生具有活性的氮段蛋白片段(GSDMD-NT)，GSDMD-NT形成聚合物后在細胞膜內面上的脂質雙分子層形成小孔。其次，作用方式不同，雖然兩者同樣為細胞膜完整性受損，表現為細胞PI染色陽性。但磷酸化的MLKL在細胞膜上產生具有選擇性的離子通道開放，而GSDMD-NT卻形成的是非選擇性的小孔[13]。本研究中，雖然細胞接受處理后死亡現象明顯，焦亡相關蛋白原形形式(caspase-1、caspase-11、GSDMD)有表達量的變化，卻均未見活性剪切體的出現，因此無法證明其中發生了焦亡，有待后續研究對其進行深入探討。

圖3 Western blotting檢測各組焦亡與壞死性凋亡相關蛋白的表達Fig.3 Expression of pyroptosis and pyroptosis-related proteins (Western blotting)

壞死性凋亡發生時，相關信號通路導致MLKL發生磷酸化激活，也使得其空間構象出現改變，MLKL通過N端的四螺旋束形成寡聚化，并轉位至細胞膜。pMLKL與TRMP7 細胞膜離子通道和Na+離子通道結合，引起Ca2+、Na+內流進而導致細胞腫脹、崩解[14]。MLKL的磷酸化即意味著壞死性凋亡的執行。

目前的研究發現壞死性凋亡參與了多種疾病的發生發展過程。例如在實驗中觀察到，當抑制了RIP1的激活后，可以減輕腦、腎臟和心臟組織的缺血再灌注損傷程度[15-17]。

而在使用腫瘤壞死因子建立的全身炎癥反應綜合征的動物模型中，相較于野生型動物組，壞死性凋亡抑制組動物存活率較高，臟器損害和炎癥反應水平也較低[18]。在VVc處理iBMDM細胞后，Western blotting檢測中可見pMLKL的表達水平上調，結合細胞上清LDH測定以及流式細胞檢測結果提示其中可能發生了壞死性凋亡。為證實這一結果，本研究采用壞死性凋亡抑制劑對此進行了反向驗證。

RIP1激酶在細胞壞死性凋亡通路中被激活后，RIP1暴露RHIM結構域，與RIP3相互結合形成巨大的淀粉樣結構，進而導致MLKL磷酸化，促發細胞發生程序性壞死及炎癥因子產生。所以RIP1是調控壞死性凋亡信號通路的關鍵因子。在實驗中，當使用RIP1的特異性抑制劑Nec-1對iBMDM細胞進行預處理后，VVc所引起的細胞死亡率和pMLKL蛋白磷酸化水平受到抑制，這一結果從另一方面證實了VVc可導致細胞出現壞死性凋亡并且是通過RIP1信號通路激發。

本研究通過Western blotting觀察到了MLKL的磷酸化水平上調，證實了壞死性凋亡的發生，且當使用RIP1的特異性抑制劑Nec-1抑制了RIPK1激酶的激活后，細胞死亡水平相應降低，提示RIP1相關的細胞壞死得到了抑制，而pMLKL相對表達量的降低則進一步揭示了Nec-1是通過RIP1/MLKL途徑抑制iBMDM細胞受到VVc作用后發生的壞死性凋亡。這對進一步理解創傷弧菌的致病機制，以及針對創傷弧菌所致膿毒癥的治療提供了一條新的思路。

致謝：感謝邵峰院士、高文青博士無償惠贈iBMDM細胞并對本研究予以幫助。

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