C/EBPβ在氧化低密度脂蛋白誘導的白介素1β成熟過程中的作用

馬駿，余三九，康華麗，鄧夢楊，黃嵐

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由脂質代謝紊亂引起的慢性炎癥性疾病，是引起心腦血管疾病的主要病因[1-2]。巨噬細胞在AS的形成過程中起著至關重要的作用。巨噬細胞吞噬脂質，分泌大量炎性分子促進AS的發生發展，同時巨噬細胞發生凋亡可導致斑塊破裂引發心腦血管事件[3-5]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)濃度升高是AS發生的關鍵性因素[6]。在ox-LDL誘導巨噬細胞形成泡沫細胞的過程中會引發細胞產生一系列炎癥反應[6-7]。炎癥反應是AS發生發展的另一重要因素[1]，白介素1β(IL-1β)即為關鍵性的促炎因子之一。在IL-1β的生成過程中，前體蛋白(pro-IL-1β)經過剪切形成成熟體蛋白(cleaved-IL-1β)，最后分泌至胞外影響動脈粥樣硬化的發生發展[8]。研究表明，IL-1β單抗治療AS引起的冠心病能明顯降低不良心血管事件發生率[9]。因此，IL-1β是治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的重要靶點，探索相關機制對于治療AS十分關鍵。近期有文獻報道CCAAT/增強子結合蛋白β(C/EBPβ)能顯著影響動脈粥樣硬化的發生，例如，與普通ApoE-/-小鼠相比，C/EBPβ敲除的ApoE-/-小鼠主動脈斑塊發生率明顯降低[10]。C/EBPβ在炎癥調控方面有著重要作用[11]，有文獻報道其可增加IL-1β前體蛋白的表達[12]，然而C/EBPβ是否可以調控IL-1β前體的成熟并不清楚。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)是調控IL-1β成熟的關鍵性蛋白[12]，C/EBPβ是否與caspase-1存在相互作用，值得探究。本研究觀察了C/EBPβ對IL-1β成熟及分泌的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 小鼠巨噬細胞株RAW264.7從ATCC細胞庫購買。RPMI 1640細胞培養基及Opti-MEM購自美國HyClone公司，胎牛血清及胰酶購自美國Gibico公司，C/EBPβ、IL-1β前體蛋白、IL-1成熟體蛋白、caspase-1及GAPDH單克隆兔抗小鼠抗體購自美國Abcam公司，RNA提取、反轉錄試劑盒及PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，ox-LDL購自中國廣州奕源生物公司，ELISA Quantikinekits試劑盒購自美國R＆D Systems公司，青霉素、鏈霉素以及Western blotting試劑盒購自中國碧云天公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞處理及分組 RAW264.7在含有7%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI 1640的培養液中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別用0、25、50、100μg/ml ox-LDL處理細胞12、24、48h，以不同時間點的0μg/ml ox-LDL為對照組，利用PCR及Western blotting檢測C/EBPβ基因及蛋白的表達變化。觀察到50μg/ml ox-LDL處理24h時C/EBPβ蛋白表達開始出現明顯上升，選擇該條件作為后續實驗的處理條件。采用50μg/ml ox-LDL處理細胞24h，以0μg/ml ox-LDL為空白對照組，Western blotting觀察ox-LDL對caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體蛋白表達的影響。隨后利用小干擾RNA對C/EBPβ及caspase-1的表達進行敲減，共分為4組，即未做處理的對照組，僅用ox-LDL處理的陰性對照組(對照+ox-LDL組)，敲減C/EBPβ并用ox-LDL處理的si-C/EBPβ+ox-LDL組，敲減caspase-1并用ox-LDL處理的si-caspase-1+ox-LDL組，觀察C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體蛋白的表達情況，并采用ELISA法檢測IL-1β的分泌情況。

1.3 小干擾RNA轉染敲減C/EBPβ及caspase-1的表達 C/EBPβ siRNA和caspase-1 siRNA均獲自上海吉瑪公司，序列如下：C/EBPβ，正義鏈5'-CCAUGGAAGUGGCCAACUUTT-3'，反義鏈5'-AAGUUGGCCACUUCCAUGGTT3'；caspase-1 RNA，正義5'-GCUGAAACAUUUGUUGCUATT-3'，反義5'-UAGCAACAAAUGUUUCAGCTT-3'。將RAW264.7細胞在6孔板(2×106個細胞/孔)中培養12h，隨后將siRNA轉入細胞。轉染后，將細胞再溫育12h，將培養基換成含有7%血清的RPMI 1640繼續培養24h。

1.4 實時定量熒光PCR檢測C/EBPβ基因的表達使用RNAiso試劑從處理的RAW264.7細胞中分離RNA。根據TaKaRa反轉錄試劑盒使用說明書將分離的RNA反轉錄為cDNA，并進行PCR。引物由上海生工合成，以GAPDH mRNA表達水平作為內參照。

1.5 Western blotting檢測相關蛋白的表達 將處理完畢的細胞取出400μl含PMSF(終濃度1mmol/L)的RIPA裂解液(碧云天)，冰上充分勻漿后，4℃、10 000r/min離心15min，并收集上清，采用BCA法進行蛋白定量，之后上樣：每泳道50μg蛋白樣品，SDS-PAGE恒壓電泳(5%濃縮膠階段設置電壓為80V，時間60min；10%分離膠階段電壓為120V，時間1h)直至蛋白分離，然后切膠，轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入C/EBPβ鼠單克隆抗體(1:1000)及GAPDH(1:5000)4℃過夜。次日，TBST洗膜3次(10min/次)。加入二抗(1:10 000，碧云天)，37℃孵育1h；TBST洗膜3次，進行曝光。以GAPDH為內參照。

1.6 ELISA檢測細胞上清液中IL-1β水平 以C/EBPβ蛋白表達明顯上升時的條件(50μg/ml ox-LDL處理24h)對細胞進行處理，觀察細胞上清液中IL-1β的水平。RAW264.7細胞接種于6孔板中，采用小干擾RNA對細胞進行轉染，ox-LDL 50μg/ml處理24h后，提取細胞上清液，按照試劑盒說明書使用ELISA Quantikine kits檢測上清液中的IL-1β水平以評估細胞IL-1β分泌情況的變化。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。數據結果均以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ox-LDL對C/EBPβ mRNA表達的影響 與空白對照組(1.3700±0.1565)相比，細胞處理12h后，50μg/ml ox-LDL組C/EBPβ mRNA表達水平(2.8510±0.2124)明顯升高(P＜0.05)，而100μg/ml ox-LDL組C/EBPβ mRNA表達進一步升高(P＜0.05)；當細胞處理24h及48h后，25μg/ml ox-LDL組C/EBPβ mRNA表達水平明顯升高(P＜0.05)，均呈濃度依賴性增加(圖1)。

2.2 ox-LDL對C/EBPβ蛋白表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，與空白對照組相比，ox-LDL刺激巨噬細胞株12h未引起C/EBPβ蛋白水平的明顯變化，而處理24h后，與對照組(0.2440±0.0219)相比，50μg/ml ox-LDL組C/EBPβ的蛋白表達(0.3839±0.0106)明顯升高，而100μg/ml ox-LDL組增加更為明顯(P＜0.05)；ox-LDL處理巨噬細胞株48h后，25μg/ml ox-LDL組C/EBPβ蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，同樣呈濃度依賴性(圖2)。

圖1 不同濃度ox-LDL處理巨噬細胞不同時間后C/EBPβ mRNA表達的變化(n=3)Fig.1 C/EBPβ mRNA expression in macrophages treated with different concentrations of ox-LDL for different time (n=3)

圖2 不同濃度ox-LDL處理巨噬細胞不同時間后C/EBPβ蛋白表達的變化(n=3，Western blotting)Fig.2 C/EBPβ protein expression in macrophages treated with different concentrations of ox-LDL for different time (n=3, Western blotting)

2.3 ox-LDL對caspase-1、IL-1β前體及IL-1β成熟體蛋白表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，50μg/ml ox-LDL刺激細胞24h后，caspase-1、IL-1β前體和成熟體蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.05，圖3)。

2.4 C/EBPβ或caspase-1敲減后caspase-1、C/EBPβ表達及IL-1β生成的影響 與對照組相比，ox-LDL能明顯增加C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前體及成熟體蛋白的表達以及IL-1β的分泌(P＜0.05，圖4)。敲減C/EBPβ之后，ox-LDL誘導的caspase-1、IL-1β前體及成熟體蛋白表達以及IL-1β分泌均被明顯抑制，與對照+ox-LDL組相比分別為0.5302±0.0253 vs.0.8121±0.049、0.6178±0.0500 vs. 0.9788±0.0959、0.2511±0.0298 vs. 0.5485±0.0664及7.626±0.665pg/ml vs. 16.25±1.223pg/ml(P＜0.05，圖4)。而敲減caspase-1之后，僅ox-LDL誘導的IL-1β成熟體表達及IL-1β分泌被抑制，對C/EBPβ及IL-1β前體蛋白的表達無明顯影響(P＜0.05，圖4)。

圖3 50μg/ml ox-LDL處理細胞24h后caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體的表達變化(n=3，Western blotting)Fig.3 Expressions of caspase-1, pro-IL-1β and cleaved-IL-1β in cells treated with 50μg/ml ox-LDL for 24h (n=3, Western blotting)

圖4 C/EBPβ及caspase-1敲減后C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體的表達及IL-1β分泌的變化(n=3)Fig.4 Expressions of C/EBPβas well as C/EBPβ, caspase-1, pro-IL-1β and cleaved-IL-1β after caspase-1 knocked down and the IL-1β secretion (n=3)

3 討 論

本研究主要觀察在ox-LDL誘導巨噬細胞釋放IL-1β的過程中，C/EBPβ是否可以調控IL-1β的產生，以及如何進行調控的。結果顯示，ox-LDL可以濃度依賴性地刺激C/EBPβ表達上升，同時，敲減C/EBPβ表達后，可以引起IL-1β前體、成熟體，以及促進IL-1β成熟的關鍵蛋白caspase-1表達的降低，最終導致IL-1β分泌減少，而敲減caspase-1并不能引起C/EBPβ表達的下降。本研究結果提示，ox-LDL能夠濃度依賴性增加巨噬細胞內C/EBPβ的表達，與先前的動物實驗結果一致[10]。然而，ox-LDL是如何增加C/EBPβ的表達并不清楚。有文獻報道Toll樣受體4(TLR4)可以直接調控C/EBPβ[13]，在ox-LDL刺激巨噬細胞后，TLR4表達升高[14]，因此，我們推測ox-LDL可能通過增加TLR4的表達來影響C/EBPβ的表達，但其中的具體機制還有待進一步研究。此外，本研究結果還顯示ox-LDL可增加IL-1β前體的表達及成熟，增加促IL-1β成熟的關鍵性蛋白caspase-1的表達，并最終增加IL-1β的分泌，這與先前的文獻報道一致[8]。在C/EBPβ表達降低之后，ox-LDL誘導的IL-1β前體、成熟體和caspase-1表達以及IL-1β分泌均明顯下降，而敲減caspase-1之后，僅IL-1β成熟體的表達以及IL-1β分泌下降，表明C/EBPβ不僅可以調控IL-1β前體的表達，還可調控caspase-1促IL-1β前體成熟的過程，并最終通過這兩方面來影響IL-1β的分泌。然而，C/EBPβ是如何調控caspase-1的目前尚無文獻報道。NLRP3炎性小體是caspase-1關鍵性的上游分子蛋白，且在脂質體刺激下表達同樣升高[15-16]，因此推測C/EBPβ調控caspase-1很可能與NLRP3有關系，然而進一步的機制有待驗證。

綜上所述，本研究證實，ox-LDL刺激巨噬細胞后，細胞內C/EBPβ表達明顯上升，并進一步引起促炎因子IL-1β的產生。C/EBPβ促進IL-1β產生的機制，一是直接增加IL-1β的表達[12]，二是通過調控caspase-1增加IL-1β前體向成熟體的轉化。C/EBPβ是調控IL-1β的一個關鍵性蛋白，有望成為動脈粥樣硬化抗炎治療的新靶點。然而，ox-LDL是如何刺激C/EBPβ，以及C/EBPβ是如何調控caspase-1表達的，仍有待進一步研究證實。

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