中草藥飼料添加劑對異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的影響

沈兆媛，魯建飛，許 丹，3，呂利群，3

( 1.上海海洋大學，國家水生動物病原庫，上海 201306； 2.上海海洋大學，農業部淡水水產種質資源重點實驗室， 上海 201306； 3.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是我國主要的淡水養殖魚類之一，據統計，鯽魚人工養殖總產量約2.0×106t，其主要養殖品種是異育銀鯽[1]。隨著養殖產量的增長及養殖區域的擴大，日益惡劣的養殖生態環境使得鯽魚病害頻繁發生。近幾年來給江蘇地區鯽魚養殖產業帶來極大困擾的Ⅱ型鯉皰疹病毒，是高致病性病毒病皰疹病毒性造血器官壞死病的致病病原[2-3]。除Ⅱ型鯉皰疹病毒對鯉科魚類造成較大的危害外，Ⅰ型鯉皰疹病毒和Ⅲ型鯉皰疹病毒對鯽魚及金魚(Carassiusauratus)養殖亦有一定危害。Ⅰ型鯉皰疹病毒引發鯉痘瘡，Ⅲ型鯉皰疹病毒感染鯉魚(Cyprinuscarpio)和錦鯉(C.carpiovar. koi)且有極高的致死率[4]。Ⅱ型鯉皰疹病毒感染鯽魚后，可在魚體表、鰓、脾臟、腎臟等組織器官明顯觀察到出血癥狀。

目前采用有效的藥物治療感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的鯽魚尚未見報道。中草藥應用于中國人類醫療中歷史悠久，因其兼具營養性及藥用性的雙重作用受到人們的廣泛關注[5]。中草藥添加劑與抗生素和其他化合物添加劑相比，其優勢在于成本低、藥物殘留及副作用小、資源豐富。水產養殖中用來抑制病原菌繁殖，增強非特異性免疫的中草藥有穿心蓮(Andrographispaniculata)、五倍子(Melaphischinensis)、當歸(Angelicasinensis)、 金銀花(Lonicerajaponica)、魚腥草(Houttuyniacordata)、黃芪(Astragalus)、黃芩(Scutellariabaicalensis)、大蒜(Alliumsativum)、苦參(Sophoraflavescens)、淫羊藿(Epimedium)、石榴皮(Punicagranatum)、菖蒲(Acoruscalamus)等[6]。Harikrishnan等[7]利用大黃(Rheumofficinale)提取物投喂異育銀鯽，可顯著提高其非特異性免疫能力。袁春濤等[8]投喂不同含量的中草藥組方飼料及強普素組方飼喂異育銀鯽，結果發現，投喂含0.5%的中草藥飼料能顯著提高異育銀鯽巨噬細胞吞噬力和呼吸爆發反應氧的產生。李俊超等[9]使用天然植物藥物處理病毒后再感染細胞，觀察到在一定含量下板藍根(Isatistinctoria)注射液對錦鯉皰疹病毒有較弱的直接殺滅作用，而銀黃、炎琥寧等沒有直接殺滅病毒的效果。各類中草藥提取物的應用研究也表明，香菇多糖、黃芪多糖、大黃蒽醌提取物等可提高水產動物的非特異性免疫能力與抗病力[10]。雖然在飼料中添加中草藥并應用于養殖生產實踐已有諸多報道，但是針對抗Ⅱ型鯉皰疹病毒效果的中草藥尚未有較大進展。筆者選用黃芪、大黃、板藍根、穿心蓮等4種具有抗Ⅱ型鯉皰疹病毒潛力的天然中草藥作為定制飼料添加劑，旨在為建立有效的防控Ⅱ型鯉皰疹病毒技術提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚購自江蘇省異育銀鯽大豐養殖基地；板藍根、大黃、黃芪、穿心蓮購自同仁堂藥店(上海市東方路店)；飼料原料均由鹽城市恒興飼料有限公司提供；Ⅱ型鯉皰疹病毒病毒株由本實驗室分離并保存；血液/組織/細胞基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；rTag酶、實時熒光定量PCR試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；ACD血液抗凝劑、引物合成均來自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗飼料

試驗飼料主要原料為面粉、豆粕、魚粉，按照《魚類營養需求》(1993)魚類營養標準配置基礎飼料，其營養水平見表1。在基礎飼料中分別添加0(對照組)、10 g/kg的板藍根、大黃、黃芪、穿心蓮配置成5 種試驗飼料。飼料原料及中草藥經粉碎后過80目篩，混勻后加水壓成粒徑為2.0～2.5 mm的顆粒料，自然晾干后密封4 ℃保存待用。

表1 基礎飼料組成及營養水平(風干基礎) %

注：1)預混料為每千克飼料提供:VC磷酸酯：200 mg;魚多

維：200 mg; 魚多礦：600 mg.2)計算值.

1.3 試驗設計與飼養管理

選用體質量為(100±10) g體型均勻的健康異育銀鯽，隨機分為5組(每組3個重復，每個重復40尾)，分別飼喂在基礎飼料中添加10 g/kg(板藍根、大黃、黃芪、穿心蓮)的試驗飼料。試驗魚暫養在水族箱中一周，水族箱半徑0.5 m，高1 m，水體積為0.628 m3，每日9:00、17:00投喂飼料約魚體質量的2%，每次投喂后換水1/3。試驗期間保持水溫在(22±1) ℃。

1.4 Ⅱ型鯉皰疹病毒感染異育銀鯽

病毒懸液制備：攻毒，將-80 ℃保存的病魚組織利用玻璃研磨器研磨后，1×磷酸鹽緩沖液以1∶5比例稀釋組織勻漿液后混勻室溫放置1 h，以3000 r/min離心30 min后，吸取上清液棄沉淀，再次以5000 r/min離心30 min，吸取上清液棄沉淀，以8000 r/min離心上清液30 min，過0.45 μm濾膜收集病毒液4 ℃保存備用。定量稀釋病毒懸液至病毒量為1.08×107個/mL，取病毒液1 mL腹腔注射異育銀鯽，對照組按同樣方法注射滅菌過的1 mL磷酸鹽緩沖液。感染期間保持水溫約23 ℃，每4 h觀察一次試驗組并記錄死亡情況。

1.5 Ⅱ型鯉皰疹病毒鑒定

取10 μL發病魚的抗凝血液置于1.5 mL離心管中，利用血液DNA提取試劑盒提取DNA,方法參照試劑盒說明書。提取DNA完畢后，利用Nano Drop 2000測定DNA含量。鑒定Ⅱ型鯉皰疹病毒引物序列F: 5′-ctt tag cgt cag gtc cat aga gg-3′、 R: 5′-cgt cag tcc ctg gca gaa ata ag-3′。PCR反應體系為50 μL：引物濃度為10 μmol/L 各1 μL;10×Buffer 5 μL;dNTP 4 μL; rTaq 酶 0.25 μL;DNA模板1 μL; 加ddH2O至50 μL。反應條件為95 ℃ 3 min; 98 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,34個循環；72 ℃ 5 min。配置1%含量的瓊脂糖膠，進行凝膠電泳，觀察結果拍照。

1.6 異育銀鯽血液中病毒滴度測定

取樣：采用尾靜脈取血法，取異育銀鯽血液加入ACD血液抗凝劑抗凝，放入1.2 mL凍存管中迅速放入液氮罐中冷凍后轉至-80 ℃冰箱保存樣品。按照天根血液DNA提取試劑盒說明書操作提取各樣品DNA，參照本實驗室建立的Ⅱ型鯉皰疹病毒絕對定量方法[11]進行實時熒光定量PCR對病毒滴度進行定量。定量前將已提取的DNA全部稀釋為50 ng/μL。病毒熒光定量PCR體系：SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL; PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL; PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL; DNA 模板(<100 ng)×2 μL; ddH2O(滅菌蒸餾水)9.5 μL;加水至25 μL。以稀釋好的病毒DNA為模板在CFX96TM Real-time PCR Detection System (Bio-Rad)實時熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR反應，計算樣品中的Ⅱ型鯉皰疹病毒含量。

2 結 果

2.1 Ⅱ型鯉皰疹病毒鑒定

為確定病毒的活性，對攻毒前的病毒懸液以及攻毒后的異育銀鯽血液進行鑒定。攻毒前，取處理過的Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液20 μL，利用DNA提取試劑盒提取其總DNA，提取方法同說明書，進行PCR反應，鑒定病毒是否正確。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳，獲得一條大小約638 bp的特異性條帶，證明病毒懸液是Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液。攻毒后各試驗組隨機取2條異育銀鯽的血液10 μL，處理后提取總DNA，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，獲得與病毒懸液樣品同樣大小的一條約638 bp的特異性條帶，證明感染成功(圖1～2)。

圖1 Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液DNA凝膠電泳圖M：Marker DL2000； 1：Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液DNA PCR產物；2：陰性對照 3：雙蒸水.

2.2 感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后異育銀鯽的臨床癥狀

感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后，可在各異育銀鯽體表觀察到體表出血，尤其是胸腹部大面積充血泛紅(圖3)；鰓部暗紅且伴有出血；脾臟腫大，肝臟部位有點狀出血；為典型的異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒癥狀(圖3)。

圖2 攻毒后血液中Ⅱ型鯉皰疹病毒 PCR擴增結果M：Marker DL2000；1～10：感染Ⅱ型鯉皰疹病毒血液DNA PCR產物；11 ：陰性對照.

圖3 感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后異育銀鯽臨床癥狀a.胸腹部體表大面積充血；b.鰓暗紅出血；c.脾臟腫大、內臟出血.

2.3 異育銀鯽死亡率及相對免疫保護率

投喂飼料過程直至攻毒，異育銀鯽未出現死亡等異常情況。各均按照魚體質量的2%投喂飼料，于投喂2個月后進行攻毒。采用實時熒光定量PCR的方法定量Ⅱ型鯉皰疹病毒滴度為1.08×107個/mL。口服穿心蓮異育銀鯽死亡率為15%；黃芪和板藍根試驗魚異育銀鯽死亡率分別為30%和35%；大黃死亡率為95%；普通飼料投喂攻毒死亡率為100%(表2)。

2.4 感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后各不同時間點的病毒滴度情況

利用絕對定量的方法，對Ⅱ型鯉皰疹病毒在各血液內的復制情況進行定量分析。攻毒后0～120 h病毒處在擴增時期，對照組在120 h時病毒滴度達107個/mL，對照組病毒滴度高于其他病毒滴度，且與投喂穿心蓮試驗組呈差異極顯著(P<0.01)。

表2 攻毒后異育銀鯽死亡率和相對免疫保護率

圖4 異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后血液中病毒滴度誤差線表示標準偏差，*P<0.01差異極顯著.

3 討 論

3.1 Ⅱ型鯉皰疹病毒感染異育銀鯽的臨床癥狀

Ⅱ型鯉皰疹病毒感染導致的異育銀鯽造血器官壞死病，使異育銀鯽出現體表及內臟器官大面積出血、眼球突出、腹鰭尾鰭發白、鰓組織出血等癥狀。Wang等[3]首次報道了我國人工養殖的異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的病例，在此之后，在北京、武漢、廣州等地也在養殖異育銀鯽體內檢測出Ⅱ型鯉皰疹病毒[12-13]。Ⅱ型鯉皰疹病毒的廣泛傳播對我國的異育銀鯽養殖產業造成了巨大的損失。本研究中，對照組感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后，異育銀鯽體表呈典型癥狀(胸腹部體表大面積充血，鰓部暗紅出血，脾臟腫大、內臟出血)與林秀秀等[14]報道的異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的臨床病變外觀基本一致 。

3.2 中草藥飼料影響異育銀鯽對Ⅱ型鯉皰疹病毒的耐受性的機制

本試驗中，投喂穿心蓮感染后，異育銀鯽死亡率為15%，其Ⅱ型鯉皰疹病毒病毒滴度低于對照組。可見穿心蓮在Ⅱ型鯉皰疹病毒的攻擊下對異育銀鯽起保護作用。劉妮等[15]將不同稀釋含量的穿心蓮水提取物作用于兔腎細胞,通過觀察細胞病變,結果表明穿心蓮水提取物體外有明顯的抗Ⅰ型皰疹病毒的作用。吳莎等[16]證明了穿心蓮內酯能對已進入細胞內的甲型流感病毒 H1N1、登革病毒 2 型、柯薩奇 B 病毒以及呼吸道合胞病毒起到一定的抑制作用。 因此，可推斷在抗病毒作用中，穿心蓮可以對異育銀鯽起到一定的保護作用，但不能抑制Ⅱ型鯉皰疹病毒在異育銀鯽血液中增殖，也不能殺死Ⅱ型鯉皰疹病毒。投喂黃芪、板藍根攻毒后，異育銀鯽死亡率分別為30%及35%，效果較為相近。黃芪中所含有的黃芪多糖，可以提高異育銀鯽機體非特異性免疫，抵抗病毒的侵襲。這與艾春漢等[17]用黃芪處理鯽魚后，可明顯看到其白細胞吞噬活性、血清溶菌酶活性及抗菌活力都顯著提高的研究結果較為一致。李俊超等[9]在細胞水平先給藥后感染及先感染后給藥中都證明板藍根具有較弱的殺死錦鯉皰疹病毒的作用，有阻止錦鯉皰疹病毒吸附和穿入細胞的作用。黃芪和板藍根以何種方式阻斷Ⅱ型鯉皰疹病毒復制還有待考證。投喂大黃顯示異育銀鯽死亡率達95%，與對照組死亡率相差不大，但其病毒滴度略低于對照組。劉波等[18]研究結果表明，投喂大黃蒽醌提取物能顯著提高建鯉(Cyprinuscarpiovar. jian)的溶菌酶、超氧化物歧化酶活性，提高機體免疫力。投喂大黃試驗組對異育銀鯽保護效果不佳，推測是大黃在臨床使用中的生熟選擇以及異育銀鯽對大黃蒽醌提取物的吸收水平影響對異育銀鯽的免疫效果。大黃蒽醌提取物在水產病害防治中應用廣泛，但主要起到抗菌的作用[19]。

3.3 Ⅱ型鯉皰疹病毒感染異育銀鯽防控方法

迄今為止，中草藥在水產養殖上的實踐應用主要有注射、口服和浸泡3種方法。其中使用注射和口服法時，能有效增強呼吸爆發及吞噬活力、白細胞數目等非特異性免疫因素，從而提高機體免疫能力，保護機體免受病原菌的侵害[20]；注射法效果明顯，但是，由于工作強度大，會使魚體產生強烈的應激反應，不適用于大規模飼養；浸泡法可以應用于大規模飼養，但作用時間短，且受環境影響大[5]。因此本試驗采用口服法，來降低對魚體的刺激。

目前對Ⅱ型鯉皰疹病毒的研究相對較少，主要停留在檢測方法的建立，尚無有效治療鯽造血器官壞死癥的藥物，多數都是以預防為主。洪徐鵬等[21]提出用漂白粉或高錳酸鉀等消毒劑對親魚或魚苗浸泡以預防該病；俞軍等[22]將聚六亞甲基胍加入異育銀鯽養殖水體中，24 h后進行攻毒，保護率超過60%。聚六亞甲基胍對感染3 d和5 d 后的鯽魚保護率達 63.33% 以上，表明聚六亞甲基胍對Ⅱ型鯉皰疹病毒引起的疾病有較好的治療效果。Zhang等[23]使用半數組織培養感染劑量1×107/mL鯉皰疹病毒Ⅱ型滅活疫苗免疫鯽魚，攻毒后試驗結果表明疫苗免疫后機體形成保護率為71.4%。本次試驗結果表明，穿心蓮作為定制飼料藥餌具有一定的抗Ⅱ型鯉皰疹病毒效果，為進一步研究預防及控制Ⅱ型鯉皰疹病毒的傳播提供了參考依據。

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