撲草凈在文蛤體內的生物富集與消除規律研究

張 望，范廣宇，陳秀開

( 連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇 連云港 222042 )

撲草凈是我國使用較為廣泛的除草劑品種，因其穩定性較高，撲草凈可通過地表徑流和滲透作用污染水體，進入食物鏈，引起動物和人體的免疫系統、生殖系統、內分泌系統和神經系統異常[1-2]。

我國曾允許撲草凈用于水產養殖。由于魚類對撲草凈的代謝規律不明確，無法評價其食品安全性，農業部于2010年發布1435號公告，明確將撲草凈列入《獸藥試行標準廢止目錄》[3]，但我國尚未對水產品中撲草凈的殘留限量作出要求[4]。目前歐盟禁止銷售和使用撲草凈，美、日兩國允許將撲草凈作為除草劑使用，但未將其用于水產養殖。日本2006年起實施“食品中殘留農業化學品肯定列表制度”，文蛤(Meretrixmeretrix)等貝類中撲草凈限量執行“一律標準”，即0.01 mg/kg[5]。

文蛤是我國沿海常見的經濟貝類，通常生長在河流入海口附近的細沙質灘涂和內灣區域，生長位置相對固定[6]，受撲草凈污染的風險較大。日本厚生勞動省分別在2012年8月[5]和2015年3月[7]通報檢出中國產文蛤體內撲草凈殘留超標，并發布命令檢查通報。目前多見文蛤對重金屬的富集效應研究[8-10]，未見關于文蛤對撲草凈等農藥的富集和消退規律研究的報道。筆者在半靜態條件下研究了文蛤對撲草凈的富集和消退規律，以期為文蛤的凈化暫養提供支撐，為貝類安全養殖和海洋環境保護提供數據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

液相色譜串聯質譜儀(QTRAP 4500，AB SCIEX，美國)；超聲波清洗器(KH800-KDB，昆山禾創超聲儀器有限公司)；氮吹儀(N-EVAP，Organomation，美國)；旋轉式蒸發器(R-215，BUCHI，瑞士)。乙腈(色譜純，Merck)；甲醇(色譜純，Merck)；甲苯(優級純，國藥)；氯化鈉(分析純，國藥)；無水硫酸鈉(分析純，國藥)；氨基柱(500 mg/3 mL，天津天興達)。撲草凈標準品由Dr．Ehrenstorfer提供，純度>98.0%。試驗用水為超純水。標準溶液配制方法：用甲醇將定量稱取的撲草凈標準品溶解并定容至100 mg/L，使用時根據所需用量用乙腈進行稀釋。

1.2 富集和消除試驗

試驗用文蛤取自江蘇省連云港市贛榆區海岸潮間帶，殼長2.5～3.0 cm。試驗前在試驗條件下暫養7 d，日換水1次，定時投喂螺旋藻(哈爾濱市潔寶水族用品有限公司)1次。試驗容器為800 mm×600 mm×230 mm的長方形塑料水槽。試驗用水為深井水自配海水，鹽度23，pH 7.8～8.0[11]，連續充氧、加溫，保持水溫為(12±1) ℃，水中溶解氧>5.0 mg/L。經檢測，試驗用文蛤、螺旋藻和試驗用水均不含撲草凈。

選擇活力良好的健康個體進行試驗，隨機分為7組，每組約400枚文蛤，設1、10、100 μg/L 3個質量濃度組和1個空白對照組。每個質量濃度組在相同的試驗條件下設置2個重復組，將2組測定的平均值作為最終結果。富集和消除試驗在半靜態條件下進行，日換藥液1次，同時投喂螺旋藻。富集試驗開始后分別于暴露后24 h(1 d)、48 h(2 d)、96 h(4 d)、144 h(6 d)、240 h(10 d)、336 h(14 d)、432 h(18 d)、528 h(22 d)、624 h(26 d)采樣，每次采樣隨機從各組取出18枚文蛤，分別放入標記清楚的自封口塑料袋中密封，-18 ℃冷凍保存。富集試驗結束后進行消除試驗，每12 h將所有試驗容器內的水換成清潔自配海水，分別在試驗開始后的第24 h(1 d)、48 h(2 d)、96 h(4 d)、192 h(8 d)、336 h(14 d)、432 h(18 d)、和528 h(22 d)進行采樣。投喂、采樣方法同富集試驗。試驗過程中及時撈出死亡的文蛤。

1.3 撲草凈含量的測定

用濾紙將所取文蛤殼表面擦干，剖開取出所有可食部分，用均質機制成勻漿，稱取勻漿后的樣品5.00 g于50 mL塑料離心管中。樣品預處理和儀器測定條件均參照文獻[12]的方法進行，檢出限為1.0 μg/kg。

1.4 數據處理方法

每個時間點的測定值取重復組的平均值。

富集系數即生物體內污染物的質量濃度與其生存環境中該污染物質量濃度的比值，用公式表示為：

BCF=Ct/C0

式中，BCF為富集系數，Ct表示文蛤體內撲草凈含量(μg/kg)，C0表示試驗水體中撲草凈含量(μg/kg)。

消除速率是污染物在單位時間內從生物體內的從體內的消除量，公式表示為：

v=Δc/Δt

式中，v為消除速率[μg/(kg·d)]，Δt表示消除試驗所用的時間(d)，Δc表示消除試驗所用時間內，文蛤體內撲草凈的消除量(μg/kg)。

采用PKSolver 2.0藥物代謝動力學參數計算程序，在計算機上處理文蛤的撲草凈含量—時間數據，計算出有關藥物動力學參數。

2 結果與分析

2.1 文蛤對不同質量濃度撲草凈的富集規律

分別做1、10、100 μg/L 3個暴露質量濃度下文蛤體內撲草凈含量隨時間變化的富集含量—時間圖(圖1)。撲草凈在文蛤體內的富集含量呈先增后降的趨勢，而后分別在不同水平(17.5、70.2、391.5 μg/kg)波動。富集含量達到最大值所需時間分別為10、14 d和18 d，最大含量分別為22.9、82.6、431.1 μg/kg，分別為水體中撲草凈質量濃度的22.9倍、8.3倍和4.3倍。富集試驗結束時，在1、10、100 μg/L暴露質量濃度下的文蛤體內撲草凈含量分別為18.0、69.3、395.9 μg/kg，分別為暴露質量濃度的18.0倍、7.0倍和4.0倍。

圖1 不同暴露質量濃度下文蛤體內撲草凈含量—時間曲線

以撲草凈暴露質量濃度為橫坐標，文蛤體內撲草凈的含量為縱坐標，分別對24、48、96、144、240、336、432、528、624 h的暴露質量濃度—富集含量關系做線性回歸分析(表1)。對回歸方程進行t檢驗，相關系數r2均達到顯著水平(P<0.05)。在相同的暴露時間，文蛤體內撲草凈的含量隨著暴露質量濃度的增加逐漸增加，二者呈顯著的正相關關系。

在1、10、100 μg/L 3個暴露質量濃度下，文蛤對撲草凈的富集系數變化趨勢相同，表現為先升后降，至某一水平維持波動狀態(圖2)。文蛤對撲草凈的富集系數最高值分別達22.9、8.3和4.3。在每個時間點文蛤對撲草凈的富集系數均隨暴露質量濃度的升高而下降，表明隨著暴露質量濃度的升高，文蛤對撲草凈的富集效率逐步下降。

表1 暴露質量濃度—富集含量關系線性回歸

圖2 文蛤暴露在不同質量濃度的撲草凈中的富集系數—時間曲線

2.2 文蛤對撲草凈的消除規律

在22 d的消除試驗過程中，1、10、100 μg/L 3個試驗組文蛤體內撲草凈含量均明顯下降(圖3)。在消除試驗第4 d，撲草凈含量均降至消除試驗開始前的50%以上；在消除試驗第22 d，1、10、100 μg/L 3個試驗組文蛤體內撲草凈含量分別降至1.6、2.9、10.4 μg/kg，分別為消除試驗開始時的8.7%、5.6%和2.6%。1、10、100 μg/L 3個試驗組文蛤對撲草凈的平均消退速率分別為0.745、2.973、17.522 μg/(kg·d)。消退速率隨著暴露質量濃度的升高而升高。結果說明，脫離暴露環境一定時間可降低文蛤體內撲草凈的含量。

圖3 文蛤體內撲草凈含量隨時間的消除變化曲線

2.3 富集動力學參數測定結果

采用PKSolver 2.0藥物代謝動力學參數計算程序，處理曝污后文蛤體內的撲草凈含量—時間數據，計算有關撲草凈在文蛤體內的動力學參數(表2)。

表2 文蛤對撲草凈的藥物代謝動力學參數

注：t1/2β：藥物的消除半衰期(h)；Tlag：時滯(h)；AUC：藥時曲線下面積[μg/(L·h)]；Cmax：富集達到平衡后，體內氨基脲含量(μg/kg)；Tmax：富集達到平衡的時間(h)；CL/F：總體清除率[L/(h·kg)].

2.4 藥時曲線下面積

藥時曲線下面積是指生物體內藥物濃度曲線對時間軸所包圍的面積，反映藥物進入體循環的相對量，代表藥物被生物體吸收利用的程度。在1、10、100 μg/L暴露質量濃度下，文蛤藥時曲線下面積依次為13093.366 μg/(L·h)(1 μg/L)< 49937.208 μg/(L·h)(10 μg/L)< 262958.232 μg/(L·h)(100 μg/L)。說明不同的暴露質量濃度下，文蛤對撲草凈的富集能力有較大差別。

2.5 藥物消除半衰期

藥物消除半衰期是指藥物質量濃度下降一半所需要的時間。其長短可反映生物體內的藥物消除速度。在1、10、100 μg/L暴露質量濃度下，文蛤的藥物消除半衰期依次為220.241 h(1 μg/L)>128.065 h(10 μg/L)> 108.780 h(100 μg/L)。說明文蛤體內撲草凈含量越高，消除速率越快。

3 討 論

3.1 文蛤對撲草凈的富集

在本試驗中，隨著暴露質量濃度的增加，文蛤對撲草凈的富集系數降低，說明在低暴露質量濃度的情況下，文蛤對撲草凈的富集作用更強。這種富集系數隨暴露質量濃度增加而減小的現象與文蛤[8-10]和魁蚶(Scapharcabroughtonii)[13]對重金屬銅和鉛、汞、砷富集規律，以及仿刺參(Apostichopusjaponicus)[14]和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[15]對撲草凈的富集規律研究結論類似。生物體對污染物的吸收主要取決于生物體體內脂肪與水體中有機物的分配[16]。在脂溶相分配平衡過程中，高暴露質量濃度組文蛤體內撲草凈質量濃度相對增加較快，體內脂肪與撲草凈結合更易達到飽和，導致隨著撲草凈暴露質量濃度的增加，文蛤對撲草凈的富集系數逐漸減小。

在暴露質量濃度為1 μg/L和10 μg/L情況下，文蛤對撲草凈的最大富集系數分別為22.9和8.3，而仿刺參和菲律賓蛤仔對相同質量濃度撲草凈的最大富集系數分別為4.70和4.38、40.3和9.54。從文蛤對撲草凈富集的時間效應來看，各暴露質量濃度下，隨著暴露時間的增加，文蛤體內的撲草凈含量升高至最大值后出現下降，而后富集速率和分解代謝速率維持在一個動態平衡中，撲草凈含量保持微小波動。在暴露質量濃度為1 μg/L和10 μg/L的情況下，文蛤對撲草凈的富集含量達到最大值所需時間分別為10 d和14 d，而田秀慧等[14-15]的研究表明，仿刺參和菲律賓蛤仔對撲草凈的富集含量達到最大值所需時間僅為1～3 d。這種差異說明，不同品種的水生動物對撲草凈的富集能力可能存在較大差異。不同品種水生動物的生理機能、體脂含量與組成、代謝轉化機制和效率等方面的差異，是導致富集能力差異的重要原因[17]。在適宜貝類生存的溫度范圍內，隨著溫度的升高，貝類的濾水率和攝食率以冪函數的形式升高[18-19]，從而影響富集速率。本試驗的水溫為(12±1) ℃，低于菲律賓蛤仔(20±1) ℃的試驗水溫[15]，可能也是富集速率差異較大的原因之一。

3.2 文蛤對撲草凈的消除

在22 d的消除試驗過程中，各試驗組的文蛤體內撲草凈含量下降趨勢逐漸趨緩，說明隨著體內撲草凈殘留量的減少，文蛤對撲草凈的代謝效率也逐漸下降。消除試驗第4 d，各試驗組的文蛤體內撲草凈含量均降至消除試驗開始前的50%以上。而對菲律賓蛤仔中撲草凈殘留的消除規律研究發現，消除試驗開始后1 d，撲草凈含量約降90%[15]。這種差異說明文蛤和菲律賓蛤仔對撲草凈的代謝能力可能存在較大差異。通常水溫每升高1 ℃，水生動物的藥物代謝和消除速率提高10%[20-21]。本試驗的水溫為(12±1) ℃，低于菲律賓蛤仔(20±1) ℃的試驗水溫[15]，可能也是消除速率差異較大的原因之一。

目前國內對水產品中撲草凈殘留無限量要求。日本實施肯定列表制度，文蛤等貝類中撲草凈含量適用于0.01 mg/kg的“一律標準”。對萊州灣海域表層海水中三嗪類除草劑殘留的調查結果顯示，該區域海水中撲草凈質量濃度最高達21.2 ng/L[22]。本課題組在豐水期和枯水期分別對連云港、南通沿海部分潮間帶海水，以及相關入海口上游淡水調查結果顯示，撲草凈含量均低于100 ng/L。推斷上述海域生長的文蛤體內撲草凈殘留量應小于22.904 μg/kg。通常情況下，采捕上岸的文蛤在上市前僅做簡單清洗，未進行一定時間暫養。根據本試驗結果推測，文蛤采捕后，在12 ℃以上的清潔海水中暫養4 d以上，可控制撲草凈殘留超標的風險。

4 結 論

試驗結果表明，在1、10、100 μg/L的撲草凈暴露質量濃度下，文蛤分別于暴露后10、14、18 d達到對撲草凈的最大富集含量，分別為22.9、82.6、431.1 μg/kg。隨著暴露時間的增加，文蛤體內撲草凈含量變化趨勢為先升后降，而后維持在某一水平波動。文蛤對撲草凈的富集系數隨暴露質量濃度的增加而減小。消除試驗過程中，文蛤體內撲草凈含量均明顯下降。消除試驗結束時，各試驗組的文蛤體內仍有撲草凈檢出。可見文蛤對撲草凈的富集和消除能力較強，但短時間內難以徹底消除。

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