檢測尿Ⅳ型膠原的磁微粒化學發光法的建立及尿Ⅳ型膠原在膜性腎病中的臨床應用

王 蕾， 陳偉琴， 徐旻一， 陳旭東

（1.上海市第八人民醫院 上海市第六人民醫院徐匯分院檢驗科，上海 200235；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院檢驗科，上海 200032）

慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）按病理分型大致可分為膜性腎病（membranous nephropathy，MN）、系膜增殖性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）及非膜性腎病（non-membranous nephropathy，N-MN）[1-2]。其中MN和MsPGN的主要病理改變為腎小球細胞外基質（extracellular matrix，ECM）積聚和系膜細胞異常增殖[3]。Ⅳ型膠原（type Ⅳ collagen，ⅣC）是腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）和腎小球ECM的主要成分。其含量、分布和結構變化與MN等的發生、發展密切相關[4-5]。目前，判斷CKD患者是否發生膜性改變的方法為腎穿刺活檢，但此方法創傷性較大，因此患者難以接受。而實驗室常規無創指標，如尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白及尿IgG等主要用于評估腎小球濾膜通透性的改變以及腎臟功能的改變[6]。因此需要尋找一種更好的無創性實驗室指標用于MN的診斷、療效監測及預后判斷。為此，本研究建立了檢測尿ⅣC的磁微粒電化學發光法，并對該方法進行了性能確認，同時探討尿ⅣC在CKD中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年12月—2017年6月于上海中醫藥大學附屬龍華醫院及上海市第八人民醫院住院且未接受糖皮質激素及免疫抑制劑治療、有明確腎臟穿刺病理診斷的CKD患者274例，其中男150例、女124例，年齡（57.4±15.6）歲。274例CKD患者中MN患者139例、MsPGN患者90例（IgA腎病75例、局灶節段腎小球硬化15例）、N-MN患者45例。根據美國腎臟病協會（the National Kidney Foundation，NKF）2002年發布的慢性腎臟病臨床實踐指南中描述的CKD分期標準[7]將139例MN患者分為5期，其中CKD1期48例、CKD2期36例、CKD3期28例、CKD4期11例、CKD5期16例。選取上海市第八人民醫院健康體檢者83名作為正常對照組，其中男45名、女38名，年齡（55.3±13.9）歲。正常對照組性別、年齡與CKD組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑

AutoLumo A2000全自動化學發光測定儀（鄭州安圖公司）及配套試劑（磁微粒化學發光法）。

1.3 方法

收集所有對象的晨尿樣本。在原有的血清ⅣC檢測試劑盒的基礎上，與廠商合作，制備適用于尿ⅣC檢測的標準品，濃度依次為0、5、10、20、50、100 ng/mL。由于ⅣC無國際公認的參考測量程序及參考物質，故根據GB/T21415—2008描述的方案，依據廠商建立的測量程序，并選用廠商工作校準品，對該方法的檢測性能進行評價。

1.4 方法學評價

參照美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP5-A2[8]、EP9-A2[9]、EP6-A[10]等文件的要求以及儀器和試劑的產品技術要求進行方法學性能評價。

1.4.1 標準曲線建立 尿ⅣC標準品濃度分別為0、5、10、20、50、100 ng/mL。以標準品濃度為橫坐標，相對光單位（relative light unit，RLU）為縱坐標，列出回歸方程。

1.4.2 最低檢測限 選擇3份低值樣本（1.5、2.7、6.2 ng/mL），每份樣本分別測定10次，得到10個檢測結果的RLU值，計算相應的尿ⅣC水平，依此得出3個水平的標準差s1、s2、s3，用線性回歸法擬合曲線，延長該線與縱坐標相交于s0（空白樣本的標準差）。3s0即為該方法的最低檢測限。

1.4.3 精密度 將低值（2.7 ng/mL）、中值（27.3 ng/mL）、高值（241.1 ng/mL）樣本批內重復檢測10次，計算出批內變異系數（coefficient of variation，CV）。將低值（3.1 ng/mL）、中值（41.8 ng/mL）樣本連續檢測4 d，每天重復測定5次，計算批間CV。

1.4.4 線性分析 取接近線性范圍上限的樣本（H）及接近線性范圍下限的樣本（L）各1份，按不同的比例制備6個濃度梯度的樣本，每份樣本重復測定2次，計算均值。將均值與理論值按照最小二乘法進行擬合，計算線性相關系數。

1.4.5 回收試驗 在已測得尿ⅣC水平的樣本中分別加入不同量的ⅣC標準品溶液，進行回收試驗。每份樣本檢測2次，取均值。比較檢測值與理論值的差異，計算回收率。

1.4.6 最佳臨界值 采用磁微粒化學發光法檢測正常對照組、MN組及MsPGN組的尿ⅣC水平。分析結果并繪制受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算約登指數，以約登指數最大時對應的尿ⅣC水平為最佳臨界值。

1.5 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 20.0軟件進行統計分析。數據均呈偏態分布，采用中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用ROC曲線評估尿ⅣC對MN的診斷效能。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尿ⅣC檢測磁微粒化學發光法的建立及方法學評估

2.1.1 標準曲線 將濃度分別為0、5、10、20、50、100 ng/mL的標準品重復檢測2次，取均值。以標準品濃度為X， RLU值為Y，進行二次擬合，繪制標準曲線。曲線擬合方程為Y=42.802X2+106 26X-10 856（r2= 0.999）。見圖1。

圖1 尿ⅣC檢測的標準曲線

2.1.2 最低檢測限 將尿ⅣC水平分別為1.5、2.7、6.2 ng/mL的標本重復測定10次，計算得s1、s2、s3分別為0.542 0、0.630 9、0.757 5 ng/mL。用線性回歸法擬合曲線，方程為Y=0.043 7X+0.492，s0=0.492，計算得磁微粒化學發光法檢測尿ⅣC的最低檢測限為1.48 ng/mL。

2.1.3 精密度 低值（2.7 ng/mL）、中值（27.3 ng/mL）和高值（241.1 ng/mL）樣本的批內CV分別為4.22%、8.16%和3.46%，符合要求（≤15%）。低值（3.1 ng/mL）、中值（41.8 ng/mL）樣本的批間CV分別為18.23%、17.61%，符合要求（≤20%）。

2.1.4 線性分析 制備6個濃度梯度的樣本，每份樣本測定2次，計算均值并與理論值按照最小二乘法擬合，計算得磁微粒化學發光法檢測尿ⅣC的線性相關系數為0.995，符合要求（r≥0.990）。見表1。

2.1.5 回收試驗 平均回收率為97.0%，符合回收率在90%～110%范圍內的要求。見表2。

2.1.6 尿ⅣC對MN的診斷效能評價

ROC曲線分析顯示，尿ⅣC診斷MN的曲線下面積 （area under curve，AUC）為0.875[95%可信區間（confidence interval，CI） 0.837～0.913]（p＜0.001），最佳臨界值為4.15 ng/mL，敏感性為79.0%，特異性為86.7%。見圖2。

表1 不同濃度梯度樣本的測定結果 （ng/mL）

表2 回收試驗結果

圖2 尿ⅣC診斷MN的ROC曲線

2.2 尿ⅣC的臨床應用評價

2.2.1 不同病理類型的CKD患者尿ⅣC水平比較MN組、MsPGN組、N-MN組尿ⅣC水平均明顯高于正常對照組（p＜0.01）。MN組、MsPGN組尿ⅣC水平均明顯高于N-MN組（p＜0.01）。見表3。

表3 不同病理類型的CKD患者尿ⅣC水平比較[ng/mL，M（P25～P75）]

2.2.2 不同CDK分期的MN患者的尿ⅣC水平比較

MN患者CKD1期與CKD2、CKD3、CKD4期比較，尿ⅣC水平差異均有統計學意義（p＜0.01），而與CKD5期比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同CDK分期的MN患者尿ⅣC水平比較[ng/mL，M（P25～P75）]

3 討論

有研究結果顯示，我國MN發病數約占原發性腎小球腎炎的23.4%[11]。2016年的統計數據顯示，MN在近11年內以每年13%的速度增長，成為發病率增長最快的腎小球疾病[11]。MN起病較為隱匿，易被漏診、誤診，且較難治愈，病情復發率高，極易出現靜脈血栓、感染和腎衰竭等并發癥[12]。目前，臨床上除腎活檢外尚無更好地診斷MN的方法或指標。雖然腎活檢技術為腎臟疾病的病理診斷提供了準確、可靠的依據，但其創傷性不容忽視。在MN及MsPGN患者中，往往特征性地表現為系膜細胞增殖和ECM進行性積聚[13-14]。ⅣC是構成腎小球ECM的主要成分之一，因此在MN及MsPGN患者基底膜與系膜中會出現ⅣC分泌明顯增加。雖然MN及MsPGN患者血清ⅣC水平會升高，但由于血清ⅣC檢測的干擾因素較多，在患肝臟疾病、心肌纖維化及肺間質纖維化等疾病時血清ⅣC水平也均可升高，故其對MN、MsPGN診斷的特異性較低。國內外相關研究結果表明，包括糖尿病腎病等在內的MN和MsPGN患者的尿ⅣC水平明顯高于正常對照組[14-16]。然而，目前尚缺乏較為理想的檢測尿ⅣC的方法，以酶聯免疫吸附試驗為檢測方法的進口試劑盒價格昂貴，操作復雜，對人員的要求較高，檢測結果穩定性也較差，因此絕大多數臨床實驗室尚未開展尿ⅣC檢測。為此，有必要建立更為敏感、特異且操作簡便、成本較低的檢測尿ⅣC的方法。本研究建立了檢測尿ⅣC的磁微粒化學發光法。性能確認實驗結果表明，該方法的最低檢測限為1.48 ng/mL，有良好的線性與重復性，低值、中值和高值樣本的批內CV分別為4.22%、8.16%和3.46%，低值和中值樣本的批間CV分別為18.23%、17.61%，正確度符合臨床要求（平均回收率為97.0%）。

本研究結果還顯示，MN組、MsPGN組、N-MN組尿ⅣC水平均明顯高于正常對照組（p＜0.01），MN組、MsPGN組尿ⅣC水平明顯高于N-MN組（p＜0.01）。由此可見，尿ⅣC對MN及MsPGN均有較高的診斷及鑒別診斷價值。將139例MN患者根據CDK分期分為5組，結果顯示CKD1～3期尿ⅣC水平逐漸升高（p＜0.01），說明隨著MN、MsPGN患者疾病的進展，ECM分泌增加，尿ⅣC水平逐漸升高。因此，尿ⅣC水平與MN、MsPGN的疾病進展相關。而CKD4、CKD5期患者尿ⅣC水平較CKD3期患者逐漸降低，這可能是由于終末期患者腎臟排泄障礙導致成份潴留所致。另外，CKD4、CKD5期患者一般為嚴重腎功能不全、腎衰竭的患者，因此部分CKD4期及所有CKD5期患者會進行腎臟透析，透析過程中部分蛋白質被濾除，這也會導致尿ⅣC水平下降。

綜上所述，本研究建立了檢測尿ⅣC的磁微粒電化學發光法。該方法敏感、特異、快速、準確，穩定性好，試劑價格低廉，適宜在臨床實驗室推廣應用。臨床應用結果證實尿ⅣC對MN及MsPGN患者具有較高的臨床應用價值。

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