單鏈抗體對豬傳染性胃腸炎病毒感染動物保護效果初探

張凡慶 陳玉雪 楊 亮 朱建國*

（1上海交通大學農業與生物學院/上海市獸醫生物技術重點實驗室，上海200240；2上海富朗特動物保健股份有限公司，上海 201502）

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）感染引起的一種高度接觸性傳染病。該病臨床癥狀表現為水泄、嘔吐、脫水，甚至導致死亡[1]。2周齡的仔豬感染TGEV后立刻出現嘔吐，接著持續多天的腹瀉，嚴重的脫水使仔豬在感染后2～5天死亡。大于2周齡的豬感染TGEV后通常會康復，但是此后生長速度緩慢，料肉比提高。TGEV由Doyle和Hutchin兩位學者在1946年首次在美國發現，我國在20世紀60年代報道了該病[2]。目前該病在全世界多個國家發生，并且該病經常與豬輪狀病毒病、豬流行性腹瀉、產腸毒素大腸桿菌病混合感染，給養豬業造成巨大的經濟損失。在我國，TGEV被列為國家B類傳染病，是我國重點防控的豬的疫病之一。

TGEV基因組為不分節段的單股正鏈RNA，RNA具有感染性。病毒基因組大小約為28.5 kb，是已知基因組最大的RNA病毒，其5’端具有甲基化的帽子結構，3’端具有共價結合的poly A尾。TGEV基因組分為7個區，除第1區和第3區分別具有2個開放閱讀框（open reading frames,ORFs） （ORF1a／ORF1b，ORF3a／ORF3b），其余每個區只有1個ORF（ORF2、ORF4、ORF6和 ORF7），排列順序為：5’-ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF3a-ORF3b-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-3’。ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF3b 和 ORF7分別編碼非結構蛋白，ORF1a和ORF1b編碼病毒的復制和轉錄聚合酶，ORF2、ORF4、ORF5、ORF6編碼病毒的結構蛋白，分別為纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）[3]。不同的病毒蛋白在病毒感染中發揮不同的作用。

單鏈抗體（single chain fragment variable,scFv）是一種基因工程抗體，它將抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區通過一個短的柔性肽段連接[4]。scFv除了具有抗體的特異性和敏感性外，還具有分子量小、易于穿透細胞膜和半衰期短等特點。此外單鏈抗體能夠在大腸桿菌中表達，并可以通過基因工程進行改造（如提高親和性或改變特異性）。目前單鏈抗體被廣泛應用于科學研究、腫瘤免疫、傳染性疾病檢測和治療。本研究分析了一株抗TGEV scFv在仔豬TGE的預防效果，為下一步大規模臨床應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞

TGEV SHXB株和豬精睪丸（ST）細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

Ni-NTA His標簽純化試劑盒購自美國Merck公司；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；抗His標簽小鼠單克隆抗體、HRP標記羊抗小鼠二抗購自Abcam公司；TMB底物顯色試劑盒購自北京天根生物科技公司。

2 方法

2.1 scFv的純化

將攜帶pet28a-scFv質粒的大腸桿菌在2×YT培養基上劃線。第2天挑取單個菌落至卡那霉素抗性液體培養基中培養。使用Ni-NTA His標簽純化試劑盒進行純化，取少量純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析。

2.2 scFv的特異性分析

取出實驗室保存的TGEV、PEDV、PRRSV、PCV2、產腸毒素大腸桿菌K88和K99菌株，37℃包被96孔ELISA板。接著向每孔中加入純化的單鏈抗體100μL，孵育后加入鼠抗His標簽一抗，PBST緩沖液洗滌后加入HRP標記的抗鼠二抗。最后加入TMB顯色液，在酶標儀上讀取OD420nm數值。

2.3 scFv的空斑實驗

將2×105個/mL的Vero細胞接種至六孔板，第2天將感染復數（MOI）為1的PEDV與200 μL的scFv共同孵育（1 mg/mL），1小時后加入細胞培養六孔板中，孵育1小時后棄去病毒-scFv混合液，加入低熔點瓊脂糖并培養48小時。待空斑出現后加入1%結晶紫溶液染色，記錄空斑數量。

2.4 scFv對仔豬腹瀉的保護實驗

取6頭21日齡長白仔豬，按以下處理分組：第1組為攻毒組，評價病毒的致病性，1頭豬，先灌胃20 mL PBS，1小時后攻入1.2×106TCID50/mL的TGEV；第2組為scFv預防組，評價scFv的使用效果，3頭豬，先灌胃20 mL濃度為400 μg/mL的scFv，1小時后攻入1.2×106TCID50/mL的TGEV；第3組為scFv處理組，評價scFv的生物安全性，1頭豬，先灌胃20 mL濃度為400 μg/mL的scFv，1小時后加入20 mL PBS；第4組為陰性對照組，1頭豬，先灌胃20 mL PBS，1小時后再灌胃20 mL PBS。在試驗的第2、4、7天觀察仔豬發病情況，記錄精神狀態、腹瀉情況和死亡數量。

分別采集發病死亡的豬以及第7天處死的豬的小腸，解剖并分離空腸、回腸組織，將組織置于10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制作切片，HE染色觀察其病理學變化。

2.5 scFv對仔豬的生物安全性評價

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便5 g，加入少量PBS后離心，取上清液。ELISA包被TGEV全病毒抗原5 μg/mL，包被封閉后加入提取的糞便上清液，檢測糞便中scFv的含量。

3 結果

3.1 抗豬傳染性胃腸炎病毒scFv的純化

將復蘇的菌株接種至含有50 μg/mL卡那霉素的2×YT培養基中，待OD600nm達到0.6時加入100 mM的IPTG，培養過夜。第2天將菌液離心，收集沉淀，沉淀超聲破碎后，使用Ni-NTA his標簽蛋白純化試劑盒純化。10%SDS-PAGE電泳結果顯示在28 kDa處有特異性條帶，證實scFv蛋白獲得了表達，并成功純化（見圖 1）。

圖1 scFv的SDS-PAGE電泳

3.2 scFv的特異性實驗

將TGEV、PEDV、PRRSV、PSV2、K88和K99病原抗原分別包被ELISA板，檢測scFv與這些病原的結合能力。ELISA結果顯示，TGEV抗原包被孔的OD值大于0.8，其他病毒或細菌包被孔抗原的OD值小于0.2。將抗原包被孔的OD值／PBS的OD值大于2.5判斷為發生反應，說明scFv能夠與TGEV結合，并且具有特異性（見圖2）。

圖2 ELISA檢測scFv特異性結果

3.3 scFv的空斑實驗

將TGEV和scFv預先共同孵育1小時，然后加入細胞，細胞上層用低熔點瓊脂糖固定，出現空斑后用結晶紫進行染色。同時設立TGEV＋PBS處理組和PBS處理組。圖3是病毒空斑經結晶紫染色后的結果，圖4是對圖3中的空斑數量計數結果。結果顯示，TGEV＋PBS處理組的平均空斑數量為167，TGEV+scFv處理組的平均空斑數量為26，兩組差異顯著，說明scFv具有中和TGEV的作用。

圖3 病毒空斑經結晶紫染色后結果

圖4 scFv的空斑實驗

3.4 scFv的仔豬保護實驗

將6頭仔豬分為攻毒組、scFv預防組、scFv處理組和陰性對照組。在感染后第2、4、7天觀察臨床癥狀，結果見表1。從表1可以看出，TGEV攻毒組在第2天開始出現精神沉郁，活動減少；第4天開始仔豬出現拉稀，糞便呈現糊狀，肛門周圍有水樣糞便。scFv預防組仔豬攻毒后第4天糞便松軟；第7天糞便正常，沒有出現拉稀癥狀。scFv處理組和陰性對照組仔豬觀察期間內的糞便正常，沒有腹瀉和精神沉郁等情況。所有組沒有出現仔豬的死亡（見表1）。綜合以上結果，scFv預先灌胃后，能夠給仔豬提供保護，抑制TGEV引起的腹瀉。

采集仔豬的空腸，石蠟包埋后染色。結果發現TGEV攻毒組的仔豬空腸絨毛上皮脫落，隱窩變淺，炎性細胞浸潤。scFv＋TGEV處理組的仔豬腸道與陰性對照組相同，說明scFv處理能夠對仔豬感染TGEV產生保護（見圖5）。

圖5 HE染色切片結果

3.5 單鏈抗體的生物安全性評價

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便加入少量PBS后離心，取上清液。ELISA檢測結果顯示單鏈抗體處理組與PBS處理組OD值相同（見圖6）。

圖6 scFv的生物安全性評價

表1 仔豬發病情況

4 討論

TGEV屬于冠狀病毒科，能夠引起仔豬嘔吐、腹瀉和脫水。目前對TGEV的防治方法為疫苗免疫懷孕母豬，母豬體內產生的抗體通過乳汁傳遞給仔豬，從而對仔豬提供保護。然而仔豬接近斷奶時抗體水平下降，容易感染TGEV，此外每頭仔豬吃奶量存在不同，容易導致抗體量吸收不足[5]。之前有研究報道使用卵黃抗體治療TGEV感染，取得了很好的效果，該研究說明抗體可以用于治療腹瀉性病毒感染。由于卵黃抗體來源于雞，給仔豬使用后可能會造成免疫反應，此外卵黃抗體生產成本高，這也是其難以大規模應用的原因[6]。本文研究了單鏈抗體對仔豬腹瀉的效果，單鏈抗體僅具有抗體可變區，避免了使用過程中的種屬差異；此外scFv能夠在大腸桿菌中大量表達，降低了使用成本。

本研究發現，將scFv預先給仔豬灌服再感染TGEV后，仔豬的精神狀態正常、沒有出現腹瀉，腸道損傷較輕。目前正在進行單鏈抗體的納米材料包被工作，該納米材料能夠保護單鏈抗體免受胃酸的降解。下一步將使用納米材料包被的單鏈抗體進行試驗，研究包被的scFv是否具有更好的治療效果。

[1]Schwegmann-wessels C,Herrler G.Transmissible gastroenteritis virus infection:a vanishing specter[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,2006,113(4):157-159.

[2]Antón IM,González S,Bullido MJ,et al.Cooperation between transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV)structural proteins in the in vitro induction of virus-specific antibodies[J].Virus Research,1996,46(1-2):111-124.

[3]Spaan W,Cavanagh D,Horzinek MC.Coronaviruses:structure and genome expression[J].Journal of General Virology,1988,69(Pt 12)(6):2939-2352.

[4]Bird RE,Hardman KD,Jacobson JW,et al.Single-chain antigen-binding proteins[J].Science,1988,242(4877):423-426.

[5]Yuan X,Lin H,Fan H.Efficacy and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing the A epitope of the TGEV S protein[J].Vaccine,2015,33(32):3900-3906.

[6]Li X,Wang L,Zhen Y,et al.Chicken egg yolk antibodies(IgY)as non-antibiotic production enhancers for use in swine production:a review [J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2015,6(1):40.