豬丁型冠狀病毒的分離鑒定與基因分析

劉懷東，孫 淼，趙 煒，薛青紅，魏春霞，才學鵬，陳 瑞，劉 燦*，孫曉林*

(1. 甘肅農業大學，蘭州 730070；2. 中國獸醫藥品監察所，北京100081；3. 陜西諾威利華生物科技有限公司，陜西楊陵 712100)

豬丁型冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是近年來危害養豬業的重要病毒性腹瀉病原，與豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhoea，PED)的發病情況極為類似，臨床上較難區分[1]。發病初期仔豬表現為哺乳、吃食后出現嘔吐，嘔吐物呈黃色或乳白色，并常伴有水樣腹瀉。發病后期，病豬表現為脫水、行走蹣跚以及精神沉郁等，發病嚴重者可能死亡[2-4]。

PDCoV屬于尼多病毒目內的冠狀病毒科，為含有囊膜的單鏈正義RNA病毒[8]。自2013年以來，在美國、韓國、中國、日本、歐洲等地檢測到PDCoV的流行[9-11]。為了進一步探究PDCoV在中國的具體流行情況，對2014-2016年間采集自河北、河南、山東、廣東和陜西省的56份糞便和腸組織樣本進行了多種腹瀉病原檢測，對確認為PDCoV陽性的樣本進行了病毒分離、全基因序列測定、比對分析與遺傳進化分析，以期為該病的防控提供基礎支撐。

1 材 料

1.1 樣本 腹瀉仔豬腸組織與糞便樣品來自于2014-2016年間收集的河北、河南、山東、廣東與陜西省等地養殖場。

1.2 細胞 ST細胞由陜西諾威利華生物科技有限公司提供。

1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒、反轉錄酶M-MLV、Ex Taq Premix以及PrimeSTAR Max Premix為寶生物工程(大連)有限公司產品。

2 方 法

2.1 病料前處理與核酸提取 取腸組織與糞便樣品少量置于15 mL離心管，添加質量體積比為1∶5的生理鹽水，使用勻漿機進行勻漿處理，然后進行3次凍融，之后于4 ℃低溫離心機進行12000 r/min離心15 min，取上清液，使用病毒DNA/RNA提取試劑盒，按說明書步驟進行核酸提取。

2.2 RT-PCR檢測 參考Linda J. Saif文獻[5]合成針對M基因的檢測引物PDCoV-M541-F: 5'-CGCGTAATCGTGTGATCTATGT-3'，PDCoV-M541-R: 5'-CCGGCCTTTGAAGTGGTTAT-3'。根據M-MLV反轉錄酶說明書進行反轉錄操作制備cDNA，然后配制PCR反應液，其中Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，補水至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min預變性；然后35個循環進行94 ℃ 30 s(變性)，55 ℃ 30 s(退火)與72 ℃ 30 s(延伸)；最后延伸72 ℃ 5 min。取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，判定檢測結果。同時參考Song D文獻[6]合成用于檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)與豬A群輪狀病毒(PRotaV)的檢測引物，用于腹瀉病料的檢測。

2.3 病毒分離 將PCR檢測為PDCoV陽性的腹瀉樣品勻漿液凍融三次，4 ℃低溫離心機中12000 r/min離心15 min后，取上清液經過0.22 μm濾膜過濾后液體[12]，接種健康ST細胞，并持續觀察細胞狀態，接毒后72～96 h收毒，或待細胞病變為80%時收毒。

2.4 全序列測定與比對分析 參考Wang L文獻[2]合成用于PDCoV全序列擴增測序的16對引物，分段擴增后送蘇州金唯智生物科技有限公司，連接pCR-Blunt載體進行測序，并拼接測序結果，比對分析測序結果與其他GenBank中PDCoV序列。

2.5 遺傳進化分析 基于測定的PDCoV SD株全序列與GenBank中另外68株PDCoV全序列，繪制進化樹，進行遺傳進化分析。

3 結 果

3.1 RT-PCR檢測結果 RT-PCR檢測結果顯示為PDCoV陽性(圖1A)，同時檢測PEDV、TGEV、PRotaV為陰性。PDCoV陽性PCR產物送測序后，比對測序結果確認為PDCoV的M基因序列。同時針對PEDV、TGEV與PRotaV的檢測均為陰性(圖1B)。

3.2 分離病毒結果 檢測為PDCoV陽性的糞便樣品，經離心取上清并過濾，接種ST細胞48 h后(48 hpi)出現明顯的細胞病變(CPE)(圖2)，同時該PDCoV毒株可在ST細胞上穩定傳代20代以上。

A: M-DL2000 DNA Marker；1-檢測為陽性的PDCoV糞便樣品；2-陽性對照(根據檢測引物合成的陽性質粒)；3-陰性對照B: M-DL2000 DNA Marker；1-TGEV陽性對照(根據檢測引物合成的陽性質粒)；2-TGEV陰性對照；3-糞便樣品；4-PEDV陽性對照(根據檢測引物合成的陽性質粒)；5-PEDV陰性對照；6-糞便樣品；7-PRotaV陽性對照(根據檢測引物合成的陽性質粒)；8-PRotaV陰性對照；9-糞便樣品A: M- DL2000 DNA Marker；1-Sample detected as PDCoV positive；2-Positive control；3- Negative control B: M- DL2000 DNA Marker；1- TGEV positive control；2- Sample detected as TGEV negative；3- TGEV negative control；4- PEDV positive control；5- Sample detected as PEDV negative；6- PEDV negative control；7- PRotaV positive control；8- Sample detected as PRotaV negative；9-PRotaV negative control圖1 腹瀉樣本PCR檢測PDCoV、TGEV、PEDV與PRotaV電泳圖Fig 1 Detection of PDCoV, TGEV, PEDV and PRotaV with diarrheal sample

A：健康ST細胞；B：ST細胞在感染PDCoV后48 h出現細胞病變(CPE)A: Healthy ST cell; B: ST cell with CPE after infection with PDCoV(48hpi)圖2 健康ST細胞與感染PDCoV的ST細胞Fig 2 Healthy ST cell and ST cell infected with PDCoV

3.3 全序列測定與比對分析結果 PDCoV SD株的完整基因組序列長度為25414個核苷酸(nt)，不包括3'polyA尾，將全序列上傳至GenBank，登錄號為MF431743。SD株與參考株HKU15-155(2012年分離)、CH/Sichuan/S27/2012和CH-HB-2014的核苷酸同源性分別為98.97%、99.06%和99.13%。此外，在nsp2區的1739至1744位(對應于HKU15-44序列)中的6 nt(TTTGAA)缺失和nsp3區的2810至2818位的9 nt(TCGGCAATG)缺失為首次出現。

將PDCoV SD株的S基因核苷酸序列以及對應氨基酸序列與另外一株分離自廣東地區的GD株進行比對分析發現，SD株與GD株的S基因上則存在約60個核苷酸點突變而無基因插入或缺失，對應16個氨基酸點突變，分別為R40S、S43T、Y46H、Q106L、D109E、H122Y、Y162D、V171E、A230P、K484E、L488Q、S589A、V629A、K641Q、K800Q、D1085E。

3.4 遺傳進化分析結果 基于GenBank上69株PDCoV全基因序列繪制進化樹(圖3)，分析進化樹發現，69株PDCoV具有明顯的地域特征，可分為3個大的分支，第一分支主要為美國毒株以及少數韓國毒株，第二分支為中國毒株(23株)，第三分支為越南與泰國毒株(6株)。其中中國PDCoV毒株呈現出4～5個小分支，充分展現了該病毒的基因多樣性特征。

4 討 論

常見的造成豬腹瀉的病毒類病原主要為豬源冠狀病毒，其中包括PEDV、TGEV與PDCoV，對于PDCoV最早的報道為2012年香港學者Woo等檢測到PDCoV HKU15-44株與HKU15-155株，并完成了兩株病毒的全基因序列測定[4]。2014年至今，中國大陸的田間PDCoV流行報道日趨增多，華中農業大學、華南農業大學、浙江大學、哈爾濱獸醫研究所與河北農業大學等科研團隊開展的PDCoV研究確認了PDCoV在我國各省的廣泛流行，病毒分離與返回感染動物試驗確認了其為仔豬腹瀉的嚴重威脅[9,12,13]。為了查明PDCoV流行病學歷史，2015年Xiao等對2004-2014年間215份腹瀉樣本進行回溯檢測，發現14份(6.51%)為PDCoV核酸陽性，其中包括2份采集自2004年安徽省的腹瀉樣本，說明PDCoV的存在時間要早于其首次被檢測確診的時間[13]。

PDCoV SD株在基因特征上與眾多中國大陸參考株全基因組序列同源性為98.5%～99.3%，其中S基因編碼的纖突蛋白被認為具有結合病毒受體與誘導產生中和抗體等作用，比對SD株與其他中國毒株S基因核苷酸序列可見較多基因突變，對應可見至少16個氨基酸位點突變，這些突變位點對于PDCoV病毒的增殖特性或致病性等表型的影響仍待后續研究；對于主要遺傳進化分析結果顯示包括SD株在內的中國大陸PDCoV與美國或東南亞其他毒株遺傳關系相對較遠，基于某一株PDCoV研發的弱毒疫苗或滅活疫苗的保護效果以及針對其他毒株的交叉保護效果仍處于未知狀態，考慮到PEDV與PDCoV等腹瀉病原對我國乃至全球養豬業每年所造成的巨大經濟損失，對于該類傳染病的持續性監測與防治研發需要有序而快速地推進。

其中對于疫病的監測方面，可以借鑒參考一些先進經驗，比如，美國的首例PDCoV臨床確診是在2014年1月的俄亥俄州與伊利諾伊州養殖場，至2014年6月3日時，已確診12個主要生豬養殖州均出現PDCoV感染，2014年6月5日，美國農業部將PEDV與PDCoV納入需要上報的疫病類型，并在農業部官網進行每周疫病流行更新報道[14]。該舉措對于美國養豬業PEDV流行的局部與整體防控意義重大。此外，對于豬丁型冠狀病毒的治療或預防仍然沒有特效藥或商品化疫苗，因此盡快研制出一種能夠有效防治豬丁型冠狀病毒病的疫苗，對于降低哺乳仔豬死亡率、減少養殖場經濟損失具有重要的意義。

★為PDCoV SD株位置★ for PDCoV SD strain圖3 基于69株PDCoV全基因序列繪制的進化樹Fig 3 Phylogenic tree based on complete genome of 69 PDCoV strains

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