雞痘病毒活疫苗污染禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的間接免疫熒光法檢測(cè)研究

孫 淼，李 嶺，李啟紅，夏業(yè)才，李慧姣，李俊平，楊承槐

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis Virus，REV)引起的一種禽類腫瘤性疾病[1-2]。雞痘的免疫防控主要使用雞痘弱毒活疫苗，免疫的成功與否主要取決于疫苗的抗原效價(jià)、純凈性及特定的使用條件。外源病毒污染是目前影響我國(guó)雞痘活疫苗質(zhì)量的嚴(yán)峻問題。國(guó)內(nèi)外已有多例關(guān)于禽用活疫苗中污染REV并造成嚴(yán)重?fù)p失的報(bào)道[3-4]。

目前，國(guó)內(nèi)外已建立了多種用于檢測(cè)REV的血清學(xué)和分子生物學(xué)方法[5-6]，這些方法常用于進(jìn)行REV的流行病學(xué)調(diào)查，或比較不同REV毒株間的核苷酸序列差異，分析其遺傳進(jìn)化規(guī)律等。也有很多研究者使用PCR的方法從禽用疫苗中檢測(cè)出REV的污染[7-8]。美國(guó)CVB實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了REV的PCR檢測(cè)方法并將其作為種毒的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，歐洲藥典中則規(guī)定使用免疫染色法對(duì)種毒中是否含有REV進(jìn)行檢驗(yàn)。

根據(jù)《獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)[9]、《中華人民共和國(guó)獸藥典》三部(二〇〇五年版)[10]規(guī)定，雞痘活疫苗必須進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)，確保疫苗使用的有效性和安全性。在進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)時(shí)，雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法均無法有效檢出REV，只有通過雞檢查法才能檢測(cè)到REV污染，但雞檢查法成本高、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)。李俊平等[11]在國(guó)內(nèi)首次通過系統(tǒng)的研究建立了禽用活疫苗中污染REV的間接免疫熒光法(Indirect Immuno-influorescence Assay, IFA)檢測(cè)方法，并被《中國(guó)獸藥典》三部(二〇一〇年版)收錄，作為禽用活疫苗檢測(cè)REV污染的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。為進(jìn)一步確定該方法對(duì)不同疫苗產(chǎn)品的檢測(cè)靈敏度并與傳統(tǒng)雞檢查法進(jìn)行比較，開展了雞痘活疫苗中污染REV的IFA檢測(cè)研究，以期為雞痘活疫苗質(zhì)量控制提供更有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞痘活疫苗 已知無外源病毒污染的樣品1批；待檢樣品60批來源于16個(gè)生產(chǎn)企業(yè)。

1.1.2 REV HA9901株 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽腫瘤病實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.3 SPF雞胚 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.4 試劑 M199營(yíng)養(yǎng)液、新生牛血清均購(gòu)自Hyclone公司；雞抗REV特異性血清，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測(cè)室制備[12]；兔抗雞IgY熒光抗體，購(gòu)自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取1000(或以上)羽份雞痘活疫苗樣品，用4 mL(或適量)不含血清的M199營(yíng)養(yǎng)液溶解，使最終為500羽份/2 mL；4 ℃，12000 g離心15 min；上清液經(jīng)0.8 μm、0.45 μm、0.22 μm、0.1 μm濾器各過濾1次，取濾液2 mL(相當(dāng)于500羽份)用于接種雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。

1.2.2 樣品接種與傳代 按常規(guī)方法制備CEF；將處理好的樣品接種于1個(gè)25 cm2的CEF單層，置37 ℃吸附1 h，棄去接種液，用含3%牛血清的M-199培養(yǎng)液洗CEF單層2次，2 mL/次，每瓶細(xì)胞加7～8 mL含3%牛血清的M199培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)到期，按照常規(guī)方法消化，取消化后1/10的細(xì)胞用2 mL含3%新生牛血清的M199營(yíng)養(yǎng)液懸浮，接種4孔48孔板，每孔接種0.5 mL。剩余細(xì)胞做好標(biāo)記，-15 ℃以下保存?zhèn)溆谩＝臃N細(xì)胞的48孔板置5% CO2，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5 d。

1.2.3 熒光染色 按照常規(guī)方法進(jìn)行間接免疫熒光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 IFA法檢測(cè)雞痘活疫苗中污染REV的最低檢出量 向每500羽份雞痘活疫苗樣品(外源病毒檢測(cè)為陰性)中分別添加0 TCID50、5 TCID50、10 TCID50、20 TCID50的REV，按1.2.1、1.2.2、1.2.3步驟用IFA方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 商品化雞痘活疫苗中污染REV的檢測(cè) 由16家企業(yè)生產(chǎn)的60批雞痘活疫苗樣品用《中國(guó)獸藥典》[13]規(guī)定的IFA方法進(jìn)行外源病毒REV的檢測(cè)。

1.2.6 IFA法與雞檢查法的符合率比較 隨機(jī)選取5批1.2.5中檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品和全部陽(yáng)性樣品，按照《中國(guó)獸藥典》[13]規(guī)定的雞檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 IFA法檢測(cè)雞痘活疫苗中污染REV的最低檢出量 表1結(jié)果顯示，每500羽份雞痘活疫苗中污染20 TCID50的REV即可檢出，即IFA檢測(cè)方法對(duì)雞痘活疫苗中污染REV的最低檢出量為每羽份疫苗中含0.04 TCID50的REV。

2.2 商品化雞痘活疫苗中污染REV的檢測(cè) 表2結(jié)果顯示，2家企業(yè)生產(chǎn)的4批活疫苗樣品中REV檢測(cè)為陽(yáng)性。

表1 雞痘活疫苗中不同REV添加量的IFA檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Result of IFA detection of REV in fowlpox live vaccine with different dosage of REV

表2 IFA法檢驗(yàn)商品雞痘活疫苗中REV污染結(jié)果Tab 2 Result of REV contamination in commercial fowlpox live vaccines using IFA method

2.3 IFA法與雞檢查法的符合率比較 表3結(jié)果顯示，IFA法檢測(cè)陽(yáng)性的4批雞痘活疫苗，雞檢查法均為陽(yáng)性；IFA法檢測(cè)陰性的5批雞痘活疫苗，雞檢查法也均為陰性，表明兩種檢測(cè)方法對(duì)9批臨床疫苗中污染REV的檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

表3 IFA法與雞檢查法的符合率比較Tab 3 Coincidence rate of IFA method and chicken test method

3 討 論

李俊平等[11]建立的IFA方法自收入《中國(guó)獸藥典》以來，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于禽用活疫苗外源病毒REV的檢驗(yàn)工作，該方法與傳統(tǒng)雞檢查法相比具有快速、準(zhǔn)確、成本低的優(yōu)點(diǎn)。通過檢驗(yàn)，從商品化雞痘活疫苗中檢測(cè)出了REV陽(yáng)性樣品，并進(jìn)一步確定了運(yùn)用IFA法檢測(cè)雞痘活疫苗中污染REV的敏感性及其與雞檢查法的符合率。

研究通過向外源病毒檢測(cè)為陰性的雞痘活疫苗中添加不同病毒含量(0 TCID50、5 TCID50、10 TCID50、20 TCID50)的REV，模擬REV的污染，并用IFA法進(jìn)行檢驗(yàn)，確定了其檢測(cè)雞痘活疫苗污染REV的最小檢出量為每500羽份污染20 TCID50的REV。Luan H[8]等通過人工添加不同劑量的REV到雞馬立克氏病活疫苗和雞痘活疫苗中，再用建立的qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明qPCR法最低可檢出每500羽份污染0.5 TCID50的REV。雖然IFA法與qPCR法比較敏感性略低，但是其檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品中可以確定含有感染性的REV病毒粒子，而qPCR法與其他PCR方法檢測(cè)的是REV的某段核苷酸序列，并不能確定是否含有感染性病毒粒子。

王景燕等[14]將禽痘活疫苗接種7日齡雛雞，采血漿接種CEF進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并分別用IFA法和PCR法進(jìn)行檢測(cè)，最終獲得1株REV游離病毒。Awad等[15]用PCR方法對(duì)30批雞痘病毒疫苗樣品檢測(cè)REV污染情況，在1批樣品中檢測(cè)到REV核酸陽(yáng)性。同時(shí)，該疫苗樣品接種5日齡SPF雞，定期采集血清用ELISA方法檢測(cè)REV抗體均為陽(yáng)性，定期采集肝臟、脾臟和法氏囊，通過組織病理學(xué)檢查，在這些器官中均存在腫瘤細(xì)胞，說明該疫苗樣品確實(shí)污染了REV。應(yīng)用IFA法對(duì)16家企業(yè)生產(chǎn)的60批商品化雞痘活疫苗進(jìn)行了REV檢測(cè)，結(jié)果2家企業(yè)生產(chǎn)的4批活疫苗IFA檢測(cè)為陽(yáng)性，說明我國(guó)雞痘活疫苗中存在污染REV的情況。

目前，對(duì)雞痘活疫苗污染REV的檢測(cè)僅限于血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，很少用雞檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。Awad等[15]將1批污染了REV的雞痘活疫苗接種SPF雞，最終檢測(cè)出REV的抗體，對(duì)PCR法進(jìn)行了驗(yàn)證。國(guó)內(nèi)學(xué)者尚無系統(tǒng)的使用雞檢查法與雞痘活疫苗污染REV的檢測(cè)方法進(jìn)行比較驗(yàn)證。雞檢查法是我國(guó)現(xiàn)行合法的能夠有效地檢測(cè)出禽用活疫苗中污染REV的方法。研究選取IFA法檢測(cè)REV為陽(yáng)性的4批雞痘活疫苗樣品通過雞檢查法都檢測(cè)到了REV的特異性抗體，而5批陰性樣品檢測(cè)均為陰性，二者檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%，再次確證了IFA方法檢測(cè)的可靠性。雞痘活疫苗污染REV的IFA檢測(cè)方法具有較高的敏感性，該方法的建立進(jìn)一步完善了禽用活疫苗外源病毒的檢驗(yàn)體系，為有效防控禽用活疫苗污染外源病毒提供了更可行有效的檢驗(yàn)手段。

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