表達豬瘟E2基因的重組偽狂犬病毒構建及其生物學特性分析

韓 爽，陳曉春，鄧 永，吳華偉，曹明慧，李俊平，夏業才

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)作為世界動物衛生組織(OIE)規定必須報告的疫病，對世界養豬業造成極大危害，是養豬業防控的重要疾病[1]。因此，涉及豬病防控用新型疫苗的研究非常活躍。E2囊膜糖蛋白是豬瘟病毒的主要結構蛋白，介導病毒感染，誘導機體產生中和抗體，是重要的保護性抗原[2]。因此，豬瘟E2蛋白是研制新型活載體疫苗、亞單位疫苗及研究豬瘟病毒致病機理的重要靶蛋白。已有研究表明，桿狀病毒表達E2亞單位滅活疫苗、重組豬瘟E2基因的腺病毒活載體疫苗、重組豬瘟E2基因的偽狂犬病毒活疫苗均表現出良好的免疫效果[3-6]。

偽狂犬病(Pseudorabies，PR或Aujeszky's disease，AD)是一種由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的急性傳染病，可引起仔豬的高死亡率，母豬的繁殖障礙，育肥豬的神經及呼吸系統癥狀，公豬的種用性能降低或喪失等，對養豬業危害極大[7]。PRV基因組為線性雙鏈DNA，約145 kb，可編碼70～100種病毒蛋白，其中含有大量與病毒增殖無關的非必需區可供外源基因的插入，是優良的活病毒載體[8]。PRV重組活疫苗對由與載體遺傳關系相近的PRV強毒引起的PR具有良好的免疫效果。

2011年以來，一度得到很好控制的豬偽狂犬病在我國又出現廣泛流行態勢。有研究表明，當前流行毒株與之前的PRV毒株相比發生了較大變異，現使用的弱毒疫苗株無法對變異株的感染提供完全保護[9]。基于PRV流行情況的變化，實驗以CSFV(C株)的主要保護性抗原基因E2為目標基因，用一株由PRV流行株(SX株)構建的五基因缺失綠色熒光標記病毒rPRV-BE[10]為親本株，通過同源重組技術構建了表達豬瘟病毒E2基因的四基因缺失重組偽狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC，并對其體外增殖特性進行了初步研究，以期為重組病毒的進一步開發應用提供實驗基礎。

1 材 料

1.1 毒株 PRV(SX株)為中國獸醫藥品監察所病毒制品檢測室人員在2012年于山西某豬場分離到的一株高致病性流行毒株；rPRV-BE，是以PRV(SX株)為基礎構建的gI、gE、US9、TK和部分UL49.5基因缺失，引入增強型綠色熒光蛋白基因EGFP的重組病毒[10]；CSFV (C株)由中國獸醫藥品監察所菌種保藏室保存。

1.2 細胞 PK15細胞，由中國獸醫藥品監察所保存。

1.3 載體及質粒 pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司；質粒pMD-US6-EGFP-US2由實驗室自行制備保存。

1.4 主要試劑 限制性內切酶SbfI、AflII、AgeI、SpeI，T4 DNA連接酶購自紐英倫生物技術(北京)有限公司；Top10感受態細胞、質粒小提試劑盒、質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；EX-Taq酶、2×GC EX-Taq Buffer、dNTPs，One Step RT-PCR Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；CSFV E2單抗為勃林格公司惠贈；FITC標記的羊抗鼠IgG購自Sigrna(上海)貿易有限公司；DNA/RNA提取試劑盒購自康寧生命科學(吳江)有限公司；KOD FX Neo購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。

1.5 主要儀器設備 二氧化碳培養箱(三洋)、恒溫培養箱(三洋)、 水浴鍋(上海博信)、PCR儀(Biometra)、電泳儀(Bio-Rad)、熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯)、凝膠成像系統(GOLD-SIM)等。

2 方 法

2.1 引物設計與合成 根據GenBank上的PRV和CSFV序列，自行設計合成系列擴增及鑒定引物(表1)，用于擴增左同源臂和gI基因、E2基因以及鑒定重組病毒。

表1 各片段擴增引物Tab 1 Sequences of PCR primer pairs

下劃線部分為引物酶切位點

The underline part is the enzyme cutting site

2.2 轉移質粒pMD-US6-US7-E2-US2的構建

2.2.1 CSFV E2基因擴增 采用DNA/RNA提取試劑盒提取CSFV(C株)基因組，以其為模板用下游引物CSFVrE2R反轉錄成cDNA，然后用引物CSFVrE2Fs/CSFVrE2R擴增E2基因，連接pEASY-Blunt Simple 克隆載體，構建質粒pEASY-Blunt-PE2S，測序正確后備用。

2.2.2 左同源臂+gI基因擴增 采用DNA/RNA提取試劑盒提取PRV(SX株)基因組，以其為模板，用引物rUS6F/rUS7R2擴增左同源臂和gI基因，擴增的目的片段連接pEASY-Blunt Simple克隆載體，構建重組質粒pEASY-Blunt-US6-US7，測序正確后備用。

2.2.3 轉移質粒構建 質粒pMD-US6-EGFP-US2與pEASY-Blunt-US6-US7經SbfI/AflII雙酶切，回收目的片段后用T4連接酶連接，獲得轉移質粒pMD-US6-US7-EGFP-US2；再以AgeI/SpeI分別雙酶切質粒pEASY-Blunt-PE2S和pMD-US6-US7-EGFP-US2，回收相應片段后用T4連接酶連接，最終獲得轉移質粒pMD-US6-US7-E2-US2(構建示意圖見圖1)，提取高濃度質粒，備用于轉染。

2.3 重組病毒的拯救

2.3.1 同源重組 病毒的同源重組在24孔細胞培養板上進行，取rPRV-BE病毒液15 μL，與3 μg轉移質粒pMD-US6-US7-E2-US2采用脂質體法共轉染長至90%左右的PK15細胞。轉染24 h后，觀察細胞病變情況，當病變達80%以上后凍融裂解細胞，裂解液在PK15細胞上盲傳3代，出現無綠色熒光細胞病變即可初步判斷重組病毒拯救成功。

圖1 pMD-US6-US7-E2-US2轉移載體構建示意圖Fig 1 Schematic diagram of transfer carrier construction

2.3.2 重組病毒的篩選 將初步獲得的疑似含有CSFV E2基因的拯救病毒rPRV-CSFV PE2SC病毒液接種已長成良好單層的PK15細胞6孔細胞板，吸附1 h后，棄去吸附液，鋪上1%的低熔點瓊脂糖，繼續培養。接種48 h后在熒光顯微鏡下觀察，挑選無熒光的單個噬斑于0.5 mL DMEM營養液中，震蕩混勻后，繼續接種已長成良好單層的PK15細胞6孔細胞板，如此純化4次，將獲得的重組病毒命名為rPRV-CSFV PE2SC。

2.3.3 鑒定

2.3.3.1 基因鑒定 將獲得的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC用PUS6dF/PUS9bR引物進行PCR鑒定，同時與野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE相同鑒定引物擴增結果進行比較。

2.3.3.2 免疫熒光鑒定 用針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體(Mab)進行IFA試驗，檢測E2蛋白表達情況。將重組病毒rPRV-CSFV PE2SC接種PK15細胞96孔細胞板，待病變達到80%～90%時棄掉上清，經滅菌PBS洗細胞2次后用80%冷丙酮固定，晾干后加入抗CSFV E2的Mab，置于濕盒中37 ℃作用1 h，再用PBS洗滌3次后，加入FITC標記的羊抗鼠IgG，再次置于濕盒中37 ℃作用1 h，用PBS洗滌3次后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

2.4 重組病毒的遺傳穩定性研究 將篩選獲得的病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細胞上連續傳20代，每5代提取感染細胞總DNA，按步驟2.3.3.1的方法進行PCR鑒定，重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第20代重組病毒rPRV-CSFV PE2SC按步驟2.3.3.2的方法進行IFA鑒定。

2.5 重組病毒一步生長曲線測定 將重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE，以0.01 MOI各接種PK15細胞12瓶，吸附1 h，用含有2%胎牛血清的DMEM補液后繼續培養，分別在感染后6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、108 h收集感染細胞，凍融3次后收毒，分別測定三種病毒不同收毒時間的滴度并繪制一步生長曲線。

3 結 果

3.1 轉移質粒的構建 質粒pEASY-Blunt-US6-US7用SbfI/AflII雙酶切，切出大小約為2324 bp和3830 bp的兩個片段(圖2)；質粒pEASY-Blunt-PE2S用AgeI/SpeI雙酶切，切出大小約為1208 bp和3830 bp的兩個片段(圖2)，與預期大小一致。經測序，結果與理論序列一致，表明質粒pEASY-Blunt-US6-US7和質粒pEASY-Blunt- PE2S構建成功。質粒pMD-US6-US7-EGFP-US2用AgeI/SpeI能切出大小約為733 bp和6852 bp的兩個片段(圖3)，引入CSFV E2基因構建的質粒pMD-US6- US7- E2-US2，用AgeI/SpeI能切出大小約為1208 bp和6852 bp 的兩個片段(圖3)。經測序，結果與理論序列一致，表明轉移質粒pMD-US6-US7- EGFP-US2和pMD-US6-US7- E2-US2構建成功。

3.2 重組病毒的拯救、純化及鑒定 轉染所收細胞裂解液，在PK15細胞上盲傳3代后出現了無綠色熒光細胞病變(圖4A)，初步判定重組病毒拯救成功。挑選無熒光的單個噬斑接種于長成良好細胞單層的PK15細胞，純化4次后獲得重組病毒rPRV-CSFV PE2SC(圖4B)。用引物PUS6dF/PUS9bR進行PCR鑒定，rPRV-CSFV PE2SC擴增到大小約為3469 bp的條帶，野毒PRV (SX株)和親本毒rPRV-BE用相同引物擴增，分別得到大小約為3550 bp和1584 bp的條帶(圖5)。經測序證實，重組病毒缺失了EGFP基因，并成功引入了PRV gI基因和CSFV(C株) E2基因。

用針對CSFV E2蛋白的MAb進行IFA試驗，結果顯示，感染重組病毒rPRV-CSFV PE2SC的PK15細胞孔中出現明顯的熒光，而陰性對照組則沒有熒光出現(圖6)。

3.3 重組病毒的遺傳穩定性 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細胞上連續傳了20代，分別以重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第5、10、15、20代重組病毒DNA為模板，用引物PUS6dF/PUS9bR進行PCR擴增鑒定，結果均擴增出大小約為3469 bp的目的片段(圖7)。取重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第20代重組病毒進行免疫熒光鑒定，結果重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第20代重組病毒感染孔中均出現明顯的熒光(圖6、8)，且熒光亮度相似，表明重組病毒能夠穩定遺傳。

M：Marker IV；1：pEASY-Blunt-PE2S的Age I/Spe I雙酶切產物；2：pEASY-Blunt-US6-US7的Sbf I/Afl II雙酶切產物M：Marker IV；1：pEASY-Blunt-PE2S enzyme digestion with Age I/Spe I；2：pEASY-Blunt-US6-US7 enzyme digestion with Sbf I/Afl II圖2 質粒pEASY-Blunt-PE2S和pEASY-Blunt-US6-US7的雙酶切鑒定電泳圖Fig 2 The double enzyme digestion results of pEASY-Blunt-PE2S and pEASY-Blunt-US6-US7

M1：Marker IV；M2：Marker DL2000；1：pMD-US6-US7-EGFP-US2的Age I/Spe I雙酶切產物；2：pMD-US6-US7-E2-US2的Age I/Spe I雙酶切產物M1：Marker IV；M2：Marker DL2000；1：pMD-US6-US7-EGFP-US2 enzyme digestion with Age I/Spe I；2：pMD-US6-US7-E2-US2 enzyme digestion with Age I/Spe I圖3 轉移質粒pMD-US6-US7-EGFP-US2和pMD-US6-US7-E2-US2的雙酶切鑒定電泳圖Fig 3 The double enzyme digestion results of pMD-US6-US7-EGFP-US2 and pMD-US6-US7-E2-US2

A.盲傳出現的無綠色熒光細胞病變；B.純化得到的重組病毒rPRV-CSFV PE2SCA.Cytopathy without green fluorescence；B.Purified recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC圖4 篩選到的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC(10×10)Fig 4 Screened recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC(10×10)

M：Marker DL5000；1：PRV(SX株)；2：rPRV-BE；3：rPRV-CSFV PE2SC圖5 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC的PCR擴增鑒定電泳圖Fig 5 Identification of recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by PCR

A.純化后的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC感染PK15細胞；B.陰性對照A. Purified recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC infected PK15 cells；B. Negative control圖6 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC 在PK15細胞中E2蛋白表達的IFA檢測結果Fig 6 Detection of E2 expression in PK15 cells infected with recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by IFA

M：Marker DL5000；1：PRV(SX株)；2：rPRV-BE；3：rPRV-CSFV PE2SC；4：rPRV-CSFV PE2SC(P5)；5：rPRV-CSFV PE2SC(P10)；6：rPRV-CSFV PE2SC(P15)；7：rPRV-CSFV PE2SC(P20)圖7 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC各代次PCR擴增鑒定電泳圖Fig 7 Identification of several generations of recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by PCR

A.純化后的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC第20代感染PK15細胞；B.陰性對照A.The 20th generation purified recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC infected PK15 cells；B. Negative control圖8 第20代重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細胞中E2蛋白表達的IFA檢測結果Fig 8 Detection of E2 protein expression in PK15 cells infected with the 20th generation recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by IFA

3.4 一步生長曲線測定 將重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE感染PK15細胞，6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、108 h后所收病毒液分別進行病毒滴度測定，繪制了一步生長曲線(圖9)。結果表明，重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在細胞內增殖速度較快，接種后6 h滴度達101.7TCID50/mL，而且接種18 h之前滴度一直高于另外兩株毒，病毒滴度到達平臺期時間較快；最高滴度出現時間三株毒都在72 h，之后重組病毒rPRV-CSFV PE2SC的滴度開始下降，其最高滴度(106.7TCID50/mL)低于野毒PRV(SX株)的108.0TCID50/mL，與親本毒rPRV-BE(107.0TCID50/mL)相近，到達平臺后滴度下降比另外兩株病毒快。

圖9 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC及野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE感染PK15細胞的一步生長曲線Fig 9 One step growth curve of recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC，wild strain(PRV SX) and parental strain(rPRV-BE)

4 討 論

基因缺失的偽狂犬病毒因其具備安全性好、基因組容量大、培養簡單、免疫期長、宿主范圍廣等優點，作為病毒載體極具開發潛力[11]。同時，隨著對偽狂犬病毒基礎研究的逐步深入，其作為重組表達載體的類型也越來越豐富。目前，已有豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) GP5基因[12]、乙型腦炎病毒(JEV) NS1基因[13]、H3N2亞型豬流感病毒(SIV) HA基因[14]、犬瘟熱病毒(CDV) H基因[15]、豬細小病毒(PPV) VP2基因和豬圓環病毒2型(PCV2) ORF2基因[16]等多種外源基因在偽狂犬病毒中獲得高效表達。

豬瘟發病率和死亡率較高，對養豬業危害很大，該病和偽狂犬病是目前威脅我國養豬業健康發展的兩種主要傳染病，如果防控不好，能夠造成嚴重的經濟損失。因此，開發一種安全有效的二價疫苗同時預防豬瘟和偽狂犬病兩種疾病，在實際生產中具有重要意義。Hooft等[17]于1996年構建了表達豬瘟病毒囊膜蛋白E1的重組偽狂犬病毒二聯基因工程疫苗M402，該疫苗免疫豬后，能同時低抗CSFV和PRV 的強毒攻擊，展示了以基因缺失型偽狂犬病毒作為活病毒載體構建重組疫苗的良好前景。除E1外，豬瘟病毒主要保護性抗原基因E2也是構建重組病毒時優先考慮的基因。重組豬瘟E2基因的偽狂犬病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2、rPRVTJ- delgE/gI/TK-E2、SA215(A)等[18-20]，均表現出良好的免疫原性。

gI、gE和TK基因已被證實與PRV致病性有關，是構建PRV缺失株的主要靶基因，gI、gE雙基因缺失疫苗[18]，gI、gE和TK三基因缺失疫苗[19-20]已廣泛使用。近年來，對皰疹病毒的研究結果表明，US9形成KIF1A-US9復合物，介導病毒在神經細胞中的順行傳導過程[21-23]，US9基因的缺失能降低PRV的毒力；UL49.5基因編碼囊膜蛋白gN，gN能抑制TAP介導的多肽往內質網的轉運，從而阻斷MHC I類復合體的裝配，下調其在細胞表面的表達，從而使病毒有可能逃避宿主CD8+T細胞的識別。1型牛皰疹病毒(BHV-1)UL49.5胞質尾缺失和胞外域30～40aa部分缺失能增強病毒侵染宿主的能力，誘導更強的細胞免疫和體液免疫[24]，在疫苗研制方面更具優勢，為偽狂犬病毒缺失株的構建提供了新思路。同時，gI、gE都屬于糖蛋白，可以產生中和抗體，保留gI有助于提高PRV的免疫原性。因此，兼顧降低PRV的致病性、提高PRV免疫原性和保證目的基因的高效表達，構建成功了TK、gE、US9全基因缺失及部分gN基因缺失，表達豬瘟病毒(CSFV C株) E2蛋白的重組偽狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。

重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細胞傳20代后，PCR及IFA檢測其插入和缺失不變，該結果與周國輝等[14]構建的表達H3N2亞型豬流感病毒HA基因的重組偽狂犬病毒rPRV-HA，Lei等[19]構建的重組病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2株的研究結果一致，表明這種插入和缺失是穩定的。重組病毒能在PK15細胞中快速增殖，到達平臺期時間早，病毒滴度峰值可達106.7TCID50/mL，與方六榮等[12]構建的表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5的重組偽狂犬病毒TK-/gG-/GP5+株(107.2TCID50/mL)，Wang等[18]構建的rPRVTJ-delgE/gI-E2株(107.0TCID50/mL)的實驗結果相近。而且重組病毒rPRV-CSFV PE2SC最高滴度與親本毒rPRV-BE相近，低于野毒PRV(SX株)的實驗結果與Wang等[18]構建的rPRVTJ-delgE/gI-E2株的實驗結果相一致。因此，用偽狂犬病毒作為載體構建含有豬瘟E2基因的重組活載體疫苗株，在理論和實踐上均是可行的。研究結果為表達豬瘟E2基因重組偽狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC的進一步開發應用提供了依據。

除此之外，基因缺失的疫苗株免疫動物后，不產生針對缺失蛋白的抗體；重組疫苗只產生針對重組CSFV E2蛋白的抗體，不會產生針對CSFV其他蛋白的抗體，所以可以通過血清學的方法將疫苗免疫豬和野毒感染豬加以區分[25]，可為CSFV和PRV根除計劃的實施提供技術保障。

參考文獻：

[1] 王 琴. 豬瘟病毒流行病學、病原致病特性及豬瘟綜合防制研究[J]. 中國農業科技導報，2006，8(5)：13-18.

Wang Q. Epidemiology，characterization of pathogenicity of classical swine fever virus and control strategies of classical swine fever[J]. Review of China Agricultural Science and Technology，2006，8(5)：13-18.

[2] Wang Z，Nie Y，Wang P，etal. Characterization of classical swine fever virus entry by using pseudotyped viruses：E1 and E2 are sufficient to mediate viral entry[J]. Virology，2004，330(1)：332-341.

[3] 張文杰，李向東，趙鐵柱，等. 豬瘟病毒E2基因在昆蟲細胞/桿狀病毒中的表達[J]. 中國實驗動物學報，2007(1)：30-34.

Zhang W J，Li X D，Zhao T Z，etal. Expression of E2 gene of classical swine fever virus in insect cell/baculovrius expression system[J]. Acta Lab Anim Sci Sin，2007(1)：30-34.

[4] 范學政，王 琴，陳振海，等. 綠色熒光蛋白基因與豬瘟兔化弱毒疫苗株E2基因在桿狀病毒中的融合表達[J]. 中國獸醫學報，2005(6)：6-8.

Fan X Z，Wang Q，Chen Z H，etal. Fusion expression of GFP and HCLV E2 gene in baculovirus system[J]. Chin J Vet Sci，2005(6)：6-8.

[5] 何 雷，張彥明，徐彥召，等. 共表達豬瘟病毒E2基因和豬白細胞介素2基因的重組腺病毒的構建及其免疫原性研究[J]. 病毒學報，2010，26(5)：385-391.

He L，Zhang Y M，Xu Y Z，etal. Construction and immuno-genicity of a recombinant adenovirus co-expressing the E2 protein of classical swine fever virus and the porcine interleukin 2 in rabbits[J]. Chinese Journal of Virology，2010，26(5)：385-391.

[6] 孫 元，祁巧芬，梁冰冰，等. 表達豬瘟病毒E2蛋白的重組腺病毒的構建及其在兔體內的免疫原性分析[J]. 生物工程學報，2008(10)：1734-1739.

Sun Y，Qi Q F，Liang B B，etal. Generation and immunogenicity of a recombinant adenovirus expressing the E2 protein of classical swine fever virus in rabbits[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2008(10)：1734-1739.

[7] 陸承平，黃青云，吳 潤，等. 獸醫微生物學[M]. 4版. 北京：中國農業出版社，2007.

Lu C P，Huang Q Y，Wu R，etal. Veterinary Microbiology[M]. 4th edition. Beijing：China Agricultural Press，2007.

[8] Tian Z，Zhou G，Zheng B，etal. A recombinant pseudorabies virus encoding the HA gene from H3N2 subtype swine influenza virus protects mice from virulent challenge[J]. Vet Immunol Immunopathology，2006，111(3/4)：211-218.

[9] An T Q，Peng J M，Tian Z J，etal. Pseudorabies virus variant in Bartha-K61- vaccinated pigs，China，2012[J]. Emerging Infectious Diseases，2013，19(11)：1749-1755.

[10] 李俊平. 偽狂犬病病毒雙熒光標記5基因缺失株的構建[P]. 中國：CN105385666A，2016-03-09.

Li J P. Construction of a 5 genes deletion and double fluorescent labeling pseudorabies virus[P]. China：CN105385666A，2016-03-09.

[11] 陳煥春，何啟蓋. 偽狂犬病[M]. 北京：中國農業出版社，2015：225-229.

Chen H C，He Q G. Pseudorabies[M]. Beijing：China Agri-cultural Press，2015：225-229.

[12] 方六榮，肖少波，江云波，等. 表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5的重組偽狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的構建及其生物學特性初步探討[J]. 病毒學報，2004，20(3)：249-254.

Fang L R，Xiao S B，Jiang Y B，etal. Construction of the recombinant pseudorabies virus TK-/gG-/GP5+expressing GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) and the preliminary study on its biological characterization[J]. Chinese Journal of Virology，2004，20(3)：249-254.

[13] Xu G，Xu X，Chen H C. Construction of recombinant pseudorabies virus expressing NS1 protein of Japanese encephalitis(SA14-14-2) virus and its safety and immunogenicity[J]．Vaccine, 2004, 22(15/16)：1846-1853.

[14] 周國輝，倪健強，田志軍，等. 表達H3N2亞型豬流感病毒HA基因重組偽狂犬病病毒的構建[J]. 畜牧獸醫學報，2005(10)：1043-1048.

Zhou G H，Ni J Q，Tian Z J，etal. Construction of a recombinant pseudorabies virus expressing the HA gene of H3N2 subtype swine influenza virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2005(10)：1043-1048.

[15] 李業偉，孫程龍，韓乃君，等. 表達犬瘟熱H基因重組偽狂犬病毒的構建及生物學特性研究[J]. 安徽農業科學，2011，39(24)：14899-14901,14974.

Li Y W，Sun C L，Han N J，etal. Construction of recombinant pseudorabies virus expressing canine distemper virus H gene and analysis on its biological characters[J]. Anhui Agricultural Science，2011，39(24)：14899-14901,14974.

[16] 徐志文，郭萬柱，陳 楊，等. 聯合表達PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重組 PRV的構建[J]. 中國獸醫科學，2009，39(10)：873-879.

Xu Z W，Guo W Z，Chen Y，etal. Construction of recombinant pseudorabies virus co-expressing ORF2 gene of porcine circovirus type 2 and VP2 gene of porcine parvovirus[J]. Chinese Veterinary Science，2009，39(10)：873-879.

[17] Hooft van Iddekinge B J，de Wind N，Wensvoort G，etal. Com-parison of the protective efficacy of recombinant pseudorabies viruses against pseudorabies and classical swine fever in pigs；influence of different promoters on gene expression and on protection[J]. Vaccine，1996，14(1)：6-12.

[18] Wang Y M，Yuan J，Cong X，etal. Generation and efficacy evaluation of a recombinant pseudorabies virus variant expressing the E2 protein of classical swine fever virus in pigs[J]. Clinical and Vaccine Immunology，2015，22(10)：1121-1129.

[19] Lei J L，Xia S L，Wang Y，etal. Safety and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant expressing the E2 protein of classical swine fever virus in pigs[J]. Immunol Lett，2016，174(1)：64-71.

[20] 徐志文，郭萬柱，朱 玲，等. 豬瘟偽狂犬病重組病毒 SA215(A) 株的構建及生物學特性研究[J]. 畜牧獸醫學報，2005，36(10)：1033-1037.

Xu Z W，Guo W Z，Zhu L，etal. Construction and characteriza-tion analysis of the recombinant virus SA215(A) strain of pseudo-rabies virus hog cholera virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2005，36(10)：1033-1037.

[21] Kratchmarov R，Kramer T，Greco T M，etal. Glycoproteins gE and gI are required for efficient KIF1A-dependent anterograde axonal transport of alpha herpesvirus particles in neurons[J]. Virology，2013，87 (17)：9431-9440.

[22] Gu Z，Dong J，Wang J，etal. A novel inactivated gE/gI deleted pseudorabies virus (PRV) vaccine completely protects pigs from an emerged variant PRV challenge [J]. Virus Research，2015，195：57-63.

[23] Lyman M G，Feierbach B，Curanovic D，etal. Pseudorabies virus Us9 directs axonal sorting of viral capsids[J]. Journal of Virology，2007，81(20)：11363-11371.

[24] Wei H, Wang Y, Chowdhury SI. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) UL49.5 luminal domain residues 30 to 32 are critical for MHC-I down-regulation in virus-infected cells[J]. PLoS One，2011，6(10)：257-264.

[25] Kimman T G，de Leeuw O，Kochan G，etal. An indirect double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) using baculovirus- expressed antigen for the detection of anti-bodies to glycoprotein E of pseudorabies virus and comparison of the method with blocking ELSIAs[J]. Clin Diagn Lab Immunol，1996，3(2)：167-174.