小反芻獸疫活疫苗二次免疫效果評價

魯立柱，柏 慶，任國堂，汪 萍，王 延，黃 炯

(1.天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830000；2. 新疆畜牧科學院獸醫研究所 新疆畜牧科學院動物臨床醫學研究中心，烏魯木齊 830000)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants, PPR)又稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)引起羊的高度接觸性傳染病。PPRV可導致高達100%的發病率和90%的死亡率。山羊通常對PPRV的敏感性比綿羊高且康復率高于綿羊[1-3]。該病是OIE法定報告動物疫病，也是全球計劃根除的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[4-5]。PPR活疫苗被用于預防該病，鑒于該疫苗可產生長達3年的免疫持續期以及我國成功消滅牛瘟的經驗，農業部印發了《全國小反芻獸疫消滅計劃(2016—2020年)》[6-7]。

為切實做好PPR消滅工作，有效保障養羊業穩定健康發展，按照《中華人民共和國動物防疫法》和《國家中長期動物疫病防治規劃(2012—2020年)》的要求，免疫地區的養羊場(戶)應做好羊群免疫工作，對新生羔羊和新補欄的羊要及時補免，并做好免疫記錄，免疫抗體合格率應達到70%以上。但在基層免疫工作中，對一些免疫背景不清、新補欄羊進行補免時，二次免疫是否會中和動物已經產生的PPR抗體從而影響免疫效果，以及對初次免疫PPR活疫苗后不產生抗體的羊進行二次免疫能否產生PPR抗體存在疑問，鑒于此開展了PPR活疫苗的二次免疫試驗研究。

1 材料與方法

1.1 供試疫苗 PPR活疫苗2016011-1批，由天康生物股份有限公司生產。

1.2 主要試劑 PPR標準陽性血清、PPR標準陰性血清、PPRV Nigeria 75/1株及Vero細胞均購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 試驗動物篩選 試驗用綿羊由昌吉興農勝商貿有限公司提供。采集1歲齡左右健康綿羊血100份，用病毒中和試驗方法[8]檢測PPR中和抗體，選擇PPR中和抗體效價小于1∶4 的綿羊80只用于試驗。

1.4 試驗分組及免疫接種 一次免疫組，綿羊30只，各頸部皮下注射PPR活疫苗1頭份，監測免疫后21～323 d PPR抗體水平；二次免疫組，綿羊50只，各頸部皮下注射PPR活疫苗1頭份。免疫后21 d，在另一側頸部皮下注射PPR活疫苗1頭份，監測二免后3～21 d PPR抗體水平。

1.5 免疫抗體檢測 將被檢羊血清及對照血清56 ℃水浴滅活30 min。在96孔細胞培養板將血清進行2倍系列稀釋，向所有血清孔中加入含100 TCID50/0.1mL的PPRV，37 ℃作用1 h后向所有孔中加入濃度為2×105/mL～3×105/mL的Vero細胞懸液0.1 mL。設立病毒回歸對照，即將100 TCID50/0.1mL病毒工作液用無血清MEM細胞培養液10倍系列稀釋成10 TCID50/0.1mL、1 TCID50/0.1mL、0.1 TCID50/0.1mL，取病毒工作液和3個稀釋度病毒液，每個病毒液接種5孔，每孔0.1 mL。置37 ℃、5% CO2中培養6 d，期間每日觀察細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)。

1.6 中和抗體結果判定 100 TCID50、10 TCID50病毒對照及陰性血清對照孔均應出現CPE，1 TCID50病毒對照部分孔出現CPE，0.1 TCID50病毒對照及陽性血清對照1∶160稀釋度以下細胞孔和細胞對照孔應不出現CPE。記錄被檢血清各稀釋度CPE孔數，以5個試驗孔均未出現CPE的血清最高稀釋度為中和抗體滴度，中和抗體滴度不小于1∶10判為陽性。

2 結 果

2.1 PPR活疫苗一次及二次免疫效果 PPR活疫苗一次免疫后21 d PPR中和抗體滴度平均可達5.18±2.87，陽性率為84%，一免后180～323 d 每個月進行一次PPR抗體檢測，PPR抗體陽性率均為83%。二次免疫后3～21 d，抗體一直呈上升趨勢，平均滴度分別為5.65±2.56、6.95±1.82、7.28±1.18、8.12±1.31，陽性率分別為90%、100%、100%、100%(表1)。

表1 二次免疫組PPR抗體檢測結果Tab 1 PPR antibody detection results of secondary immunization group

2.2 PPR活疫苗持續期檢測結果 PPR活疫苗免疫持續期可以達到3年，通過本次10個多月的檢測，免疫后323 d PPR抗體滴度仍然維持在6.59±1.24(圖1)，陽性率為83%。

圖1 一次免疫組PPR抗體水平消長曲線圖Fig 1 Dynamic curves of PPR antibody levels in primary immunization group

3 討 論

PPR活疫苗是一種通過Vero細胞培養的弱毒活疫苗，基于對原宿主失去致病力或致病力弱但仍具有免疫保護性的Nigeria 75/1株制成。PPR活疫苗自2007年10月開始在我國應用，宋躍君、何利昆等人分別對PPR活疫苗的免疫效果進行了試驗，結果證實疫苗在免疫場中應用半年后PPR抗體陽性率可達83.2%，一年后達90.3%[9-10]。雖然免疫抗體合格率達到了70%以上的要求，但由于羊個體敏感性差異及防疫人員免疫操作水平、疫苗保存條件等因素仍造成了部分羊未達到免疫保護標準。在疫病爆發時仍會造成養殖戶的損失。通過對PPR活疫苗的二次免疫試驗證實，一次免疫后21 d抗體陰性率為16%，二次免疫7 d后抗體陽性率為100%，說明在一次免疫中沒有產生抗體的羊經二次免疫抗體合格率能達到100%，且對已經產生的PPR抗體不會產生中和抵消作用。

PPR活疫苗免疫持續期可以達到3年，通過本次10個多月的檢測，免疫后323 d PPR抗體滴度仍然維持在6.59±1.24，陽性率為83%。另外，不同品種的羊對該疫苗的免疫效果也有差異，徐雅萍等對免疫PPR活疫苗的湖羊進行檢測表明湖羊在免疫該疫苗后14 d免疫合格率能達到100%，7個月后免疫合格率降至88.24%[11]。因此，對免疫一段時間后部分羊PPR抗體降低的現象，還是推薦進行二次免疫。由于條件限制未對二次免疫羊群進行免疫持續期監測，但從抗體水平及陽性率考慮，其持續期應不低于一次免疫羊群。

疫苗在基層的應用中，可能遇到免疫背景不清的羊群，在不具備檢測條件的情況下是否需要進行羊群免疫是基層工作者的疑慮。通過二次免疫試驗證實，對已經有PPR抗體的羊進行再次免疫，羊群平均抗體水平未出現中和反應引起的抗體下降現象，相反，二免后PPR抗體陽性率明顯提高至100%。因此，養殖戶可根據羊群的免疫情況及疫病的爆發情況，選擇是否進行疫苗二次免疫。二次免疫試驗結果可對PPR疫苗的免疫防控工作提供指導，在疫病爆發時對羊群可集中免疫，同時對免疫背景不清的羊群也應當進行免疫。

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