高效液相色譜法測定6種獸用中藥散劑中的利福平

章安源，李有志，張志民，張傳津，馮 濤，陳 玲，劉道中

(山東省獸藥質量檢驗所；山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南250022)

2012年，我國發布了國家中長期動物疫病防治規劃[1]。奶牛結核病計劃至2020年全國7省達到維持或凈化標準[2]。養殖過程中抗菌藥物的廣泛使用(甚至濫用)易造成動物源性細菌耐藥性的出現，多重耐藥菌便可以通過食物傳播到人類，耐藥基因可在人類、動物和環境之間進行傳播[3]，威脅動物源性食品和公共衛生的安全。

我國農業部為大力打擊非法添加違禁藥物，已經版布的2448號公告制訂了多種中獸藥散劑非法添加解熱鎮痛、金剛烷胺類等化學藥物檢查方法[4]。但利福平是人用藥，已發布的公告中尚不涉及利福平的檢查，研究旨在建立一種簡單、方便、適用的高效液相色譜法，對獸用中藥散劑中違規添加利福平進行定性定量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀Waterse2695 (配二極管陣列檢測器2998)；AE-240電子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)；KQ-250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對照品 利福平對照品來自中國食品藥品檢定研究院，批號130496-201703，含量98.8%。

1.2.2 陰性樣品 麻黃魚腥草散、雞痢靈散、金花平喘散、定喘散、銀翹散制備：按比例[5]稱取藥材，置粉碎機中粉碎,混合均勻后為陰性樣品；四黃止痢顆粒由山東某企業提供，未檢測出利福平的合格產品，作為陰性樣品。

1.2.3 陽性添加樣品 按照1.2.2項下方法處理后陰性樣品添加利福平對照品，混勻。

1.2.4 試劑 甲醇、乙腈，為色譜純，德國Merck公司；磷酸二氫鉀，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液為0.04 mol/L 磷酸二氫鉀溶液[6]。

1.3 檢測方法

1.3.1 高效液相色譜條件 色譜柱為waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相為乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液(35∶35∶30)；檢測器為二極管陣列檢測器；采集波長范圍200～400 nm，分辨率1.2 nm；記錄237 nm波長處的色譜圖、光譜圖中純度角度、純度閾值及PDA/FLR 匹配1角度、PDA/FLR匹配1閾值；流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL。

1.3.2 陰性樣品溶液的制備 按1.2.2方法將處理后的樣品各稱取1.0 g置錐形瓶中，加入流動相50 mL，超聲處理20 min，靜置，濾過，取續濾液1.0 mL，加流動相定容至100 mL容量瓶中，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液上機。

1.3.3 陽性樣品溶液的制備 按1.3.2方法制備的陰性樣品中每1 mL添加0.1 mg利福平，混勻作為陽性添加樣品。

1.3.4 對照品溶液的配制 精密稱取利福平對照品100 mg(精確到0.1 mg)加流動相定量稀釋成每1 mL含100 μg溶液(臨用前避光配制)[7]，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液上機。

2 結 果

2.1 專屬性試驗 照1.3.1項下條件，精密吸取對照品溶液、陰性樣品溶液、陽性樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀。對照品溶液237 nm處有最大吸收波長(圖1)保留時間約為6.953 min的峰(圖2)。陽性樣品溶液色譜圖中的利福平峰(圖3～圖14)與對照品出峰時間一致。

圖1 對照品溶液(100 μg/mL)光譜圖Fig 1 Ultra-violet spectra of reference substance

圖2 對照品溶液色譜圖(100 μg/mL)Fig 2 The chromatogram of reference substance

圖3 麻黃魚腥草散陰性樣品溶液Fig 3 The chromatogram of negative sample of Manghuangyuxingcao San

圖4 麻黃魚腥草散陽性樣品溶液Fig 4 The spiked sample of Manghuangyuxingcao San

圖5 雞痢靈散陰性樣品溶液Fig 5 The cromatogram of negative sample Jililing San

圖6 雞痢靈散陽性樣品溶液Fig 6 The spiked sampleof Jililing San

圖7 定喘散陰性樣品溶液Fig 7 The chromatogram of negative sample of Dingchuan San

圖8 定喘散陽性樣品溶液Fig 8 The spiked sample of Dingchuan San

圖9 銀翹散陰性樣品溶液Fig 9 The chromatogram of negative sample of Yinqiao San

圖10 銀翹散陽性樣品溶液Fig 10 The spiked sample of Yinqiao San

圖11 金花平喘散陰性樣品溶液Fig 11 The chromatogram of negative sample of Jinhuapingchuan San

圖12 金花平喘散陽性樣品溶液Fig 12 The spiked sample of Jinhuapingchuan San

圖13 四黃止痢顆粒陰性樣品溶液Fig 13 The chromatogram of negative sample of Sihuangzhili kel

圖14 四黃止痢顆粒陽性樣品溶液Fig 14 The spiked sample of Sihuangzhili keli

2.2 峰純度及光譜匹配檢查圖 建立對照品溶液中利福平峰的光譜庫，對陽性樣品溶液和對照品溶液中保留時間約為6.93 min的峰進行峰純度檢查，純度角度小于純度閾值(圖15,圖17)；PDA/FLR匹配1角度小于PDA/FLR匹配1閾值(圖16,圖18)。

圖15 利福平峰純度圖Fig 15 The peak purity test of the reference substance

圖16 利福平光譜匹配圖Fig 16 Matching angle and threshold in the reference substance

圖17 麻黃魚腥草散中陽性樣品中福平峰純度圖Fig 17 The peak purity test of the spiked sample of Manghuangyuxingcao San

圖18 麻黃魚腥草散陽性樣品中利福平峰匹配圖Fig 18 Matching angle and threshold in the spiked sample of Manghuangyuxingcao San

2.3 檢測限試驗 取1.3.4項下儲備液，分別配制濃度為500、50、25、10、5、0.5 μg/mL的溶液，進行測定，同時記錄色譜圖與光譜圖，得出光譜圖失真濃度是0.5 μg/mL，故為方法檢出限濃度。

2.4 線性關系考察 精密量取利福平對照品貯備液，用流動相逐級稀釋成5、10、25、50、100、250 μg/mL的系列溶液，注入液相色譜儀，按照1.3.1條件下測定，按利福平面積與對應的濃度做標準曲線，并計算回歸方程和相關系數(R2)，回歸方程為：y=22404x-5001.4(r2=0.9997)。結果表明，利福平在5～250 μg/mL的濃度范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取0.10 mg/mL的利福平對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在1.3.1條件下進行測定，連續測定6次，峰面積RSD為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同批四黃止痢顆粒(批號為20170101，標識生產單位為山東某生物科技有限公司)，按1.3.2項下制備6份樣品溶液，分別注入液相色譜儀，在1.3.1項下測定含量，RSD為0.5%，表明重復性好。

2.7 回收率試驗 按1.3.3項下方法制備陽性添加樣品，每種樣品各平行6份，制備成樣品溶液后，按照外標法定量，分別注入液相色譜儀，在1.3.1條件下進行測定，利福平平均回收率為92.9%～93.7%之間，RSD在0.4%～1.13%之間，顯示該方法回收率較好，準確度較高。結果見表1。

2.8 耐用性試驗 從柱溫、流動相、色譜柱三個方面考察方法的耐用性。分別改變柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃；調整流動相中弱酸緩沖液濃度及比例,使用不同品牌、不同型號的色譜柱：Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)； Agilent Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)等，進樣分析，考察色譜條件變動時該方法的耐用性。

2.8.1 穩定性試驗 取同一對照品溶液，于制備后 0、2、4、6、12、24 h注入液相色譜儀，在1.3.1項下條件分別進行測定，利福平峰面積的RSD為0.2%，表明溶液在24 h內穩定。

2.8.2 判定依據 在相同條件下，在200～400 nm波長范圍內供試品出現的色譜峰與對照品色譜峰保留時間相一致(差異小于等于±5%)；兩者光譜圖無明顯差異(必要時可調整供試品溶液的濃度)；最大吸收處波長一致(差異小于等于±2 nm)，則判為檢出被測試藥物[4]。上述研究表明，6種陽性添加樣品色譜圖中出現未知峰與對照品出峰時間一致，吸光度一致；純度角小于純度閾值，PDA/FLR1匹配角1小于PDA/FLR1匹配1閾值，說明二者光譜均勻，未包裹共流出物，均為單一物質峰。故判定此陽性添加樣品中出現的未知峰為利福平。

3 討論與小結

3.1 波長、流動相的比例及柱溫選擇 利福平在237和334 nm有最大吸收，前者的吸收強度明顯高于后者，故選擇定量波長為237 nm。利福平為弱酸性藥物，在相對弱酸環境下穩定[6,8]，試驗中分別選用乙腈和甲醇溶解對照品，超聲20 min后，對照品未完全溶解，可見異物?？紤]到藥物性質及吸光度的穩定性，采用弱酸性的流動相較乙腈和甲醇快速、完全溶解樣品，故選擇流動相提取和稀釋樣品。通過調整流動相中緩沖液濃度為0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液(比例30%～40%)和0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(比例30%～40%)運行樣品，其中，后者在運行低濃度樣品時，利福平色譜峰易受到試劑峰或雜質峰的干擾，分離度較差，峰形較差，柱壓高；而使用低比例30%，低濃度0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液運行樣品，分離效果好，峰形對稱，保留時間適當，柱壓穩定。故篩選乙腈∶甲醇∶濃度0.04 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(比例30%)=35∶35∶30作為試驗流動相。相較之于25 ℃柱溫，30 ℃柱溫時系統柱壓明顯降低，峰形好，出峰時間穩定，35 ℃柱溫與30 ℃柱溫效果差別不大，30 ℃溫度即可滿足檢測要求，故對柱溫做具體規定調整到30 ℃。更換不同廠家的同類型色譜柱分別進行測定，出峰時間及峰型無明顯差異，利福平含量的RSD為1.1%，表明色譜柱的微小變動對測量結果無明顯影響。

表1 利福平添加回收率試驗結果(n=6)Tab 1 The resultof the recovery rate of rifampicin

3.2 獸用中藥散劑種類的選擇及啟示 中藥屬于天然藥物，殘留毒物量小，在現代養殖業預防和控制疾病發揮重要作用[9-11],散劑中的許多中藥成分有抗感染、抗病毒，止痢的功效，添加利福平突出其止痢平喘抗感染功效。散劑性狀是粉末狀，與利福平易混勻，外觀不易發現，故篩選本試驗6種中獸醫散劑作為陰性樣品檢測。

從篩選該批散劑的非法添加物到建立檢測方法，對打擊獸藥處方外添加提供了一定的思路，提示獸藥的非法添加不僅僅局限于獸用藥，也有可能添加人用藥物。目前，我國中獸藥散劑中檢測利福平的方法還沒有完全建立，采用HPLC法建立了6種中獸藥散劑中利福平的檢測方法。該方法快速、簡便、靈敏度高，為獸藥行業健康發展大力推廣使用的檢測方法，有較好的實際應用價值。

參考文獻：

[1] 國務院.國務院辦公廳關于印發國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)的通知[Z].

Circular of the general office of the State Council on the issuance of the national long-term plan(2012-2020)[Z].

[2] 孫淑芳,王媛媛,劉陸世，等. 發達國家牛結核病根除計劃的法律要點分析[J].中國動物檢疫,2015,32(12):41-44.

Sun S F, Wang Y Y,Liu L S,etal. Analysis of key legal points of bovine tuberculosis eradication plans in developed[J].China Animal Health Inspection，2015,32(12):41-44.

[3] 王 娟，王新華，徐 海,等. 多重耐藥菌在人類、動物和環境的耐藥和傳播機制[J].微生物學報，2016,56(11): 1671-1679.

Wang J,Wang X h,Xu H，etal. Research on drug resistance and transmission mechanism of multidrug resistant organisms in human, animal and environment[J].Acta Microbiologica Sinica，2016,56(11): 1671-1679.

[4] 中華人民共和國農業部.公告第 2448號[S].

Ministry of Agriculture of the People's Republic of China. Bulle-tin No.2448[S].

[5] 中華人民共和國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典2015年版獸藥典[S].

Chinese Veterinary Pharmacopeia Commission. China Veterinary Pharmacopoeia 2015[S].

[6] 張利斌，張曉慶，郝曉輝，等. HPLC 對肺結核患者利福平血藥濃度的監測[J].同濟大學學報醫學版，2012,33(3)：664-667.

Zhang L B,Zhang X Q,Hao X H,etal. Monitoring of plasma rifampicin concentrations in patients with pulmonary tuberculosis by HPLC[J].Journal of Tongji University(Medical Science)，2012,33(3)：664-667.

[7] 崔艷莉，嚴 寒，何 瓊，等. 高效液相色譜法檢測 5種獸用中藥制劑中的利福平[J].中國獸藥雜志，2015,49(6)：49-53.

Cui Y L,Yan H，He Q，etal. Detection of Rifampicin in the Five Veterinary Traditional Chinese Herb Medicine Powders by HPLC[J].Chinese Journal of Veterinary Drug，2015,49(6)：49-53.

[8] 謝永國，于 俊，丁紅梓. HPLC法測定利福平在血清中的濃度并作老年患者的藥代動力學研究[J].藥學與臨床研究. 2017,25(4):305-307.

Xie Y G, Yu J, Ding H Z. Determination of Plasma Rifampicin by HPLC and Study of Its Pharma-cokinetics in Elder Patients[J]. Pharmaceutical and Clinical Research.2017,25(4): 305-307.

[9] Somchit M N,Reezal I,Nur I Elysha,etal.Invitro an-timicrobial activity of ethanol and waterextracts of Cassiaalata[J].Journal of Ethno-pharmacology,2003,84(1): 1-4.

[10] Zakaria E A.The inhibitory action of aqueous garlic extract on the growth of certain pathog-enic bacteria [J]. European Food Research and Technology, 2004, 218(5): 460-464.

[11] 張純萍，宋 立，吳辰斌，等.我國動物源細菌耐藥性監測系統簡介[J].中國動物檢疫，2017,34(3):34-38.

Zhang C P, Song L, Wu C B,etal. Drug Resistance Surveillance Network for Zoonotic Bacteria in China[J].China Animal Health Inspection，2017,34(3): 34-38.