黃芪發酵前后黃酮含量及指紋圖譜比較研究

侯美如，尹珺伊，王 巖，劉 宇，陳楠楠，秦平偉，史同瑞，楊淑萍

(黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

黃芪是我國一種傳統藥材，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢的干燥根。性溫、味甘，為常用補氣藥。黃芪含黃酮類、多糖類、皂苷類、氨基酸及多種微量元素等活性成分。其中，黃酮類是含量較高的一類成分，具有清除自由基、調節免疫、抗病毒等多方面的藥理作用，是黃芪中重要的有效成分，因此黃酮類成分常作為黃芪藥材的質量控制指標之一，黃酮化合物主要包括毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷及芒柄花素等[1]。為此，選擇以上4種黃酮作為參考指標，用于評價固體發酵對黃芪成分的影響。

中藥發酵作為中藥加工的一種炮制工藝已具有悠久的歷史，目前，應用現代生物技術發酵轉化中藥也已成為中藥領域的研究熱點。應用具有分解和轉化能力的微生物發酵中藥，可保護中藥活性成分免受煎、煮、熬、煉、蒸、浸等傳統工藝造成的破壞，能夠提高中藥有效成分的提取率，降解中藥大分子物質，產生新的活性物質，降低中藥毒副作用[2-4]。然而，發酵中藥作為中藥產品的一種新型制劑尚無規范性的質量標準，這嚴重影響了發酵中藥質量的有效控制和臨床應用。隨著，液相色譜技術的發展，為探究中藥發酵前后成分及含量的變化提供了有效手段。在適宜的色譜條件下，可將中藥中不同成分在不同時間節點洗脫，并由檢測器檢測，從而直觀的顯示出中藥不同成分及相對含量，這為比較發酵前后成分差異提供了可靠依據[5]。研究應用HPLC-UV方法，對產纖維素酶解淀粉芽胞桿菌發酵黃芪散劑中4種黃酮含量及色譜圖進行了比較，旨在為其質量控制提供技術支撐，為生產應用提供質量保障。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT二元泵，Labsolution色譜工作站,日本島津公司產品；KQ5200B超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產品；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產品；ZNCL-S自能恒溫磁力攪拌器，上海羌強儀器設備有限公司產品；PINE-TREE帕恩特標準試劑級超純水機，北京湘順源科技有限公司產品；恒溫振蕩器HZQ-FX型，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司產品。

1.2 菌株與試劑 產纖維素酶解淀粉芽胞桿菌SSYB株，由本研究室分離鑒定并保存；刺芒柄花苷、芒柄花黃素含量、毛蕊異黃酮苷含量、毛蕊異黃酮(含量均≥98%，批號分別為：R04J6F2、KO1014CB14、PS0912SA13、P29M6R2)，上海源葉生物科技有限公司產品；黃芪，河北凱達藥業有限公司產品；乙腈(色譜純，批號：20161210)，天津市科密歐化學試劑有限公司產品；甲醇(色譜純，批號：20161108),天津市科密歐化學試劑有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 標準品制備 精密稱取標準品毛蕊異黃酮苷7.9 mg，刺芒柄花苷3.2 mg，毛蕊異黃酮2.9 mg，芒柄花素6.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，定容至刻度，備用。

1.3.2 發酵黃芪及對照品制備 發酵黃芪：按照黃芪粉30%、黃豆粉10%、CaCO30.2%、水59.8%組分制備發酵培養基。取解淀粉芽孢桿菌種子液，以2%接種量接種黃芪發酵培養基，在37 ℃發酵培養72 h，發酵物中活菌數約為7.67×108CFU/g。

對照黃芪：另外取無菌肉湯，按2%接種量接種黃芪固態發酵培養基，按照發酵黃芪制備方法進行處理。

1.3.3 成分提取 取發酵黃芪與非發酵黃芪各5 g，分別加入甲醇30 mL，超聲提取30 min，重復提取3次，合并提取液，于70 ℃水浴揮干溶劑，加8 mL甲醇溶液超聲溶解，待完全溶解后定容至10 mL，搖勻，經0.45 μm濾膜過濾，超聲除氣，備用。

1.3.4 檢測方法建立

1.3.4.1 色譜條件 Inertsustain C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈和水，檢測波長：254 nm，柱溫：25℃，流速：1 mL/min，進樣量：20 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Conditions of gradient elution

1.3.4.2 適應性考察 取標準品溶液，經超聲，過0.45 μm濾膜后進樣20 μL，考察4種黃酮對上述色譜條件的適應性。

1.3.4.3 線性關系考察 用甲醇稀釋標準品溶液，分別為原濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64倍，搖勻，經0.45 μm濾膜過濾，超聲除氣，備用。按上述色譜條件對毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4種黃酮含量進行測定，以液相色譜峰峰面積(A)對濃度(mg/L)(C)繪制標準曲線。

1.3.4.4 精密度試驗 精密吸取標準品溶液20 μL，

重復進針6次，測定4種黃酮峰面積，對精密度試驗進行考察。

1.3.4.5 穩定性試驗 取標準品溶液分別于放置0、2、4、6、8、10 h 進針1次，測其峰面積，對穩定性試驗進行考察。

1.3.5 黃酮含量的測定 取發酵黃芪及對照黃芪提取液各20 μL，按上述色譜條件對兩種提取液樣品中的黃酮含量進行測定。

2 結 果

2.1 檢測方法建立

2.1.1 適應性考察 取標準品溶液，經超聲，過0.45 μm濾膜后進樣20 μL，結果見圖1。毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素標準品分別在13.024、21.102、26.900、40.749 min出現獨立峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。發酵組及對照組中的目標峰分離效果較好，且對不同成分峰的分離程度較為理想，可用于比較黃芪發酵前后成分的變化。

Ⅰ：毛蕊異黃酮苷；Ⅱ：刺芒柄花苷；Ⅲ：毛蕊異黃酮；Ⅳ：芒柄花素Ⅰ：Calycosin 7-O-glucoside；Ⅱ：Ononin；Ⅲ：Calycosin；Ⅳ：Formononetin圖1 標準品(A)、黃芪發酵組(B)及黃芪對照組(C)色譜圖Fig 1 Standard product chromatogram (A), Astragalus fermentation chromatogram (B) and Radix astragalus chromatogram(C).

2.1.2 線性關系考察 按上述色譜條件對毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4種黃酮含量進行測定，以液相色譜峰峰面積(A)對濃度(mg/L)(C)繪制標準曲線。建立回歸方程，分別為：AⅠ=640.91C+246.75(r=0.9992)；AⅡ=716.96C+174.57(r=0.9991)；AⅢ=119.86C+253.17(r=0.9995)；AⅣ=1270.93C+194.64(r=0.9992)。結果表明，4種黃酮色譜峰面積與濃度呈良好線性的濃度范圍分別是12.34～790、5.0～320、4.53～290、9.53～610 mg/L。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取標準品溶液20 μL，重復進針6次，測定4種黃酮峰面積。RSD分別為1.21%、0.98%、1.64%和1.12%。結果表明，進樣精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 取標準品溶液分別于放置0、2、4、6、8、10 h進針1次，測其峰面積。4種黃酮峰面積的RSD分別為1.42%、1.03%、1.83%和1.34%。結果表明，供試品溶液在10 h內穩定。

2.2 黃酮含量的測定 取發酵黃芪及對照黃芪提取液各20 μL，按上述色譜條件對兩種提取液樣品中的黃酮含量進行測定。由表2可知，發酵黃芪與對照黃芪提取液中均含有黃酮中的3種成分，即毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素。發酵黃芪含量分別為12.236±0.232、0.201±0.021和0.737±0.041 mg/g；對照黃芪含量分別為0.327±0.013、5.453±0.078和12.847±0.118 mg/g。發酵黃芪中毛蕊異黃酮苷含量顯著高于對照黃芪(P<0.01)，而毛蕊異黃酮和芒柄花素含量顯著低于對照黃芪(P<0.01)。

表2 黃芪發酵前后4種黃酮含量Tab 2 The content of four flavonoids before and after

“-”未在相對保留時間出現色譜峰

2.3 發酵黃芪色圖譜比對 發酵黃芪與對照黃芪色譜圖比較發現，兩者指紋圖譜差異較大，相似度低，說明黃芪經發酵后成分發生了很大變化，見圖2。經比對分析可知，發酵黃芪與對照黃芪保留時間點一致的吸收峰(RSD<1%)共有15個，占出峰總數的30%～33%，但相同保留時間點的吸收峰面積差異較大，其中，在0.928、1.326、9.017、14.762、22.538、24.850、41.657 h 7個保留時間點，發酵黃芪的吸收峰面積均較對照黃芪有所增大，增大幅度為170%～810%，差異極顯著(P<0.01)。而另8個保留時間點的吸收峰面積均較對照黃芪縮小，其中，有1個保留時間點的吸收峰面積縮小69.08%，其它7個保留時間點均縮小90%以上。

以大于色譜峰總面積2%的單峰為目標峰，發酵黃芪中有8個，而對照黃芪有15個，其中，發酵黃芪在1.560、1.752、2.604、3.279、8.338、39.546 h出現6個新的吸收峰，而在1.675、1.965、2.417、5.240、7.779、17.988、20.109 h的7個原有吸收峰消失。此外，與對照黃芪比較，發酵黃芪在1.560、1.752 h新出現2個極高峰，其峰面積分別占總面積的33.4%、22.2%，而在1.965 h點處峰面積占總面積23.29%的1個原有極高峰消失，見圖3、圖4。試驗結果表明，黃芪發酵后產生了許多新的特征吸收峰，同時原有的多數吸收峰消失，這說明黃芪經發酵后，原有成分及含量發生了變化，一些原有成分消失，同時也產生了新的物質。

數據1：發酵黃芪色譜圖；數據2：對照黃芪色譜圖Data1 Fermentation of astragalus chromatogram;Data2 Control of astragalus chromatogram圖2 黃芪發酵前后液相色譜對比圖Fig 2 Comparison diagram of liquid chromatography before and after fermentation of astraglus

圖3 發酵黃芪色譜圖Fig 3 Fermentation of astragalus chromatogram

圖4 黃芪色譜圖Fig 4 Astragalus chromatogram

3 討論與小結

中藥發酵制品多以主要有效成分及其含量為質量控制制備，然而由于中藥成分繁多，生物發酵過程復雜，僅以中藥主要活性成分含量作為質量控制指標難以保證中藥制品質量。一些學者提出，采用中藥色譜指紋圖譜技術，對中藥及其制品進行整體性的質量控制與評價。史玉霞[6]運用檢測波長254 nm，乙腈-磷酸為流動相，梯度洗脫，對何首烏提取液益生菌發酵前后化學成分進行研究，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.7%，該方法穩定性好，為評價何首烏藥材不同炮制品的質量奠定了基礎。李崗[7]等運用HPLC法對消栓口服液發酵前后指紋圖譜進行比較，發現二者指紋圖譜間差異較大，相似度低，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”對15批樣品進行相似度評價，結果符合指紋圖譜研究的技術要求。本試驗采用乙腈和水為流動相，梯度洗脫，檢測波長254 nm，柱溫25 ℃；流速1 mL/min，在此條件下，檢測發酵黃芪與對照黃芪樣品，結果目標峰及其他成分峰分離效果好，適于比較發酵黃芪成分的變化。

依據標準品在液相色譜中形成的目標峰，可以判斷樣品對應色譜峰的物質[8]。試驗選擇了黃芪中4種黃酮成分作為參考指標，評估生物發酵對黃芪成分及其含量的影響。在檢測的4種黃酮成分中，發酵黃芪毛蕊異黃酮苷含量顯著升高，而毛蕊異黃酮和芒柄花素含量顯著降低。這說明黃芪發酵后，一些物質轉化生成為毛蕊異黃酮苷，而毛蕊異黃酮和芒柄花素基本被轉化為其他物質。黃芪經發酵后，雖然有15種成分未被全部轉化利用，但其含量發生了顯著變化，其中，有7種成分含量較對照黃芪升高了1.7～8.1倍，而另8種成分含量卻顯著降低，且其中7種成分近于消失。在單峰面積大于色譜峰總面積2%的15種成分中，黃芪經發酵后有7種成分消失，其中包括一種含量占23.29%的主要物質，同時又生成6種新物質，且有兩種新生主要物質，含量分別為33.4%、22.2%，為進一步考察黃芪中其他主要成分的變化，實驗也分別運用紫外分光光度法及液相色譜法對黃芪多糖、黃芪甲苷發酵先后質量變化進行了測定，對比發現，發酵后黃芪多糖及黃芪甲苷的含量均有升高，分別為升高了39.59%[9]、37.59%。由此推測，解淀粉芽孢桿菌生長代謝能將黃芪成分轉化、利用，同時也產生了一些新物質，這一結果被許多學者研究證實。阮鳴等[10]研究表明，在黃芪發酵過程中，黃芪甲苷被轉化形成6-O-B-D-葡萄糖基-環黃芪醇，該轉化物具有顯著的抗氧化效應，具有增效的作用。肖麗麗等[11]經薄層層析檢測證實，生物發酵可將黃芪總皂苷中的部分皂苷轉化為黃芪甲苷。

發酵中藥作為一種中藥新產品尚無規范性的質量標準，這嚴重影響了發酵中藥質量的有效控制和臨床應用，本文運用HPLC法，通過對解淀粉芽孢桿菌發酵黃芪有效成分及色譜圖對比，發現黃芪發酵前后其成分發生了很大變化，但究竟轉化利用了何物質，以及產生了何種新物質及其發生機理還有待進一步研究。中藥成分復雜，要準確測定其各成分及含量難度較大，測定中藥指紋圖譜，可初步確定中藥化學組成及含量差異。在中藥指紋圖譜測定中，高效液相色譜法具有流動相選擇廣，色譜柱可反復利用，簡便，快速等特點，因此，本文對產纖維素酶解淀粉芽胞桿菌發酵黃芪的一些成分及色譜圖進行了研究，旨在為發酵黃芪制品質量控制提供技術參考。

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