加米霉素注射液特殊安全性試驗研究

張云茜，鄧 菲，路美玉

(華北制藥集團(tuán)動物保健品有限責(zé)任公司，石家莊050041)

加米霉素注射液屬動物專用大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，已上市產(chǎn)品為法國梅里亞公司的Zactran。主要作用于溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等引起牛呼吸道疾病的病原菌[1]。此外，對牛傳染性胸膜肺炎的病原體-絲狀支原體絲狀亞種[2]、馬鏈球菌獸疫亞種和對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥和敏感的馬紅球菌[3]以及豬肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌[4]均具有較好的體外抗菌活性。由于加米霉素在靶組織中有較高的活性濃度，對呼吸系統(tǒng)疾病病原菌藥效迅速且持久[5]，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、動物專用、單次給藥、吸收迅速、生物利用度高、低殘留、安全高效等優(yōu)點，故在動物呼吸道感染性疾病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[6-8]。我國已批準(zhǔn)進(jìn)口該藥[9]，根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告要求，在國內(nèi)生產(chǎn)此產(chǎn)品，須進(jìn)行特殊安全性試驗[10]。鑒于國內(nèi)當(dāng)前沒有加米霉素注射液臨床使用有關(guān)全部特殊安全性方面的資料，本研究旨在通過豚鼠、大白兔的皮膚致敏、皮膚刺激、局部刺激、紅細(xì)胞溶血試驗，全面考察加米霉素注射液的特殊安全性，從而為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 加米霉素注射液，150 mg/mL，由華北制藥集團(tuán)動物保健品有限責(zé)任公司提供，批號：GMM03-1-GMM1。陽性對照藥物：2，4-二硝基氯苯(含量99%)，購自sigma 公司。

1.2 試驗動物 新西蘭大白兔(體重2.5～3 kg)34只，雌雄各半，單籠、常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京市海淀興隆實驗動物養(yǎng)殖廠提供，動物質(zhì)量合格證編號為：NO.1180 5800001198；豚鼠系Hartley種白化豚鼠40只(一級，體重260～320 g)，雌雄各半，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京市海淀興旺動物養(yǎng)殖場提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2016-0003。

1.3 試驗方法及判定原則

1.3.1 皮膚刺激試驗 采用新西蘭大白兔進(jìn)行，分組及劑量見表1。取加米霉素注射劑，直接涂布于左側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布(2.5 cm×2.5 cm)和一層無刺激塑料膜覆蓋，再用無刺激膠布固定，家兔的右側(cè)去毛皮膚涂布賦形劑(生理鹽水)作對照。貼敷4 h后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。每天一次，連續(xù)7 d，每次給藥時間相同。

每次去除藥物后1 h以及再次貼敷前觀察去毛部位皮膚是否有紅斑、水腫及其他異常表現(xiàn)，并在末次給藥后1、24、48、72 h肉眼觀察去毛部位皮膚局部反應(yīng)，按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[11](以下簡稱《原則》)進(jìn)行刺激反應(yīng)評分。以受試動物評分積分的平均值進(jìn)行綜合評價,最高積分均值﹤0.50，無刺激性；0.50～2.99，輕度刺激性；3.00～5.99中度刺激性；6.00～8.00強(qiáng)刺激性。

表1 皮膚刺激試驗分組、劑量Tab 1 Test group and dose of skin irrigation response

1.3.2 皮膚致敏試驗 采用白化豚鼠進(jìn)行，分組及劑量見表2，以豚鼠背部左側(cè)皮膚進(jìn)行染毒。先進(jìn)行誘導(dǎo)接觸，分別在試驗0、7、14 d時，在試驗組豚鼠左側(cè)備皮處涂敷加米霉素注射液，在陽性對照組動物相同部位涂敷2，4-二硝基氯苯。末次誘導(dǎo)后14 d進(jìn)行激發(fā)接觸，實驗組和陰性對照組涂敷加米霉素注射劑，陽性對照組動物涂敷2，4-二硝基氯苯。

激發(fā)接觸實驗染毒后24、48、72 h，根據(jù)《原則》評判是否出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)并判定致敏強(qiáng)度。

表2 皮膚致敏試驗分組、劑量Tab 2 Test group and dose of skin sensitization response

1.3.3 肌肉刺激試驗 采用新西蘭大白兔進(jìn)行，分組及劑量見表3。試驗前24 h剪去兩側(cè)股四頭肌部位的兔毛，碘酊和乙醇消毒后分別在右側(cè)股四頭肌注入受試藥物，左側(cè)股四頭肌注入同樣體積的滅菌0.9%氯化鈉溶液作對照。

給予受試物后4、12、24、48 h觀察皮膚表面的反應(yīng)及變化情況。觀察48 h后將家兔處死，剖開股四頭肌，肉眼觀察注射部位肌肉組織的藥液吸收情況，檢查注射局部是否產(chǎn)生刺激性反應(yīng)；并將高、中、低劑量組和對照組各4只(雌雄各兩只)注射部位肌肉進(jìn)行病理學(xué)檢驗。根據(jù)《原則》進(jìn)行刺激反應(yīng)評分。

表3 肌肉刺激試驗分組、劑量Tab 3 Test group and dose of muscle irritation response

1.3.4 溶血試驗 試驗動物為新西蘭大白兔2只，采用體外試管法，即肉眼觀察法進(jìn)行，分組及劑量見表4。采心臟血50 mL，制成脫纖血液，處理后置 37±0.5 ℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育。15 min、1 h、2 h、3 h各觀察1次，若試驗中的溶液呈澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留，表明有溶血發(fā)生；如紅細(xì)胞全部下沉，上清液體無色澄明，表明無溶血發(fā)生。若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細(xì)胞凝聚發(fā)生。如有紅細(xì)胞凝聚的現(xiàn)象，進(jìn)一步判定是真凝聚還是假凝聚。

2 結(jié)果及分析

2.1 皮膚刺激試驗 8只受試新西蘭大白兔連續(xù)給藥7 d期間，在其去毛部位均未觀察到皮膚紅斑、水腫及其他異常表現(xiàn)，且在停藥后觀察期限內(nèi)的各個時間點均未出現(xiàn)紅斑和水腫等刺激反應(yīng)，見圖1；根據(jù)《原則》判定受試物加米霉素注射液各個時間點的刺激反應(yīng)積分均值為0，與陰性對照組比較無顯著差異, 詳見表5，表明受試物加米霉素注射劑對新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

2.2 皮膚致敏試驗 受試藥物組和陰性對照組豚鼠的皮膚在激發(fā)給藥24、48、72 h后，皮膚均未見紅斑和水腫現(xiàn)象(圖2)；根據(jù)《原則》判定受試藥物組和陰性對照過敏反應(yīng)率為0，而陽性對照組豚鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重或中度紅斑和水腫，過敏反應(yīng)發(fā)生率為100%，詳見表6。表明受試藥物加米霉素注射劑對豚鼠皮膚進(jìn)行誘導(dǎo)后不出現(xiàn)過敏反應(yīng)，試驗結(jié)果為陰性。

2.3 肌肉刺激試驗 給予受試物后4、12、24、48 h均未觀察到注射部位充血、瘙癢、起包。給予受試物后48 h處死各劑量組和對照組各4只(雌雄各兩只)家兔，病理顯示其組織注射部位血管未見出血、血栓、血管擴(kuò)張充血、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤及血管壁周圍組織壞死等異常改變,詳見圖3。判定各個時間點的刺激反應(yīng)積分均值為0，與陰性對照組比較無顯著差異，詳見表7，由此表明受試物加米霉素注射劑對新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

表5 皮膚刺激分值Tab 5 Skin irritation score

賦形劑對照組(給藥1 d) 受試藥物組(給藥1 d)Excipient Control group (medicated 1 d) Tested medicine group(medicated 1 d)

賦形劑對照組(停藥后72h) 受試藥物組(停藥后72h)Excipient Control group (withdrawal after72 h) Tested medicine group(withdrawal after72 h)

受試藥物組 陰性對照組 陽性對照組圖2 豚鼠給藥后72 h皮膚致敏結(jié)果Fig 2 Results of guinea pigs skin sensitization after administration 72 h

時間(Time)/h分組(Gruop)皮膚紅斑分值(Skin erythema scores)皮膚水腫分值(Skin edema scores)012340123過敏率(Allergy rate)/%24 陽性(Positive)004600037100陰性(Negative)100000100000試驗(Test)20000020000048 陽性(Positive)007300046100陰性(Negative)100000100000試驗(Test)20000020000072 陽性(Positive)007210046100陰性(Negative)200000200000試驗(Test)100000100000

對照組(給藥前) 高劑量組(給藥前)

對照組(給藥后48 h) 高劑量組(給藥后48 h)

對照組(剖檢) 高劑量組(剖檢)

對照組 高劑量組

劑量(Dose)動物編號(Animal No.)對照(Control)試驗(Test)高(High dose)100200300400500600700800中(Medium dose)9001000110012001300140015001600低(Low dose)17001800190020002100220023002400

2.4 溶血試驗 試驗結(jié)果顯示1～6號試管在3 h內(nèi)紅細(xì)胞全部下沉，上清液體均為澄明，溶液中未見有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀；7號試管有棕紅色絮狀沉淀，振搖后不分散，詳見圖4，將凝聚物滴加2滴 0.9%氯化鈉溶液，置顯微鏡下觀察，凝聚物不被沖散。可判定受試藥物及陰性對照未發(fā)生溶血和凝聚，陽性對照組發(fā)生溶血，表明加米霉素注射劑對兔紅細(xì)胞無溶血和凝聚作用，可以注射使用。

3 結(jié) 論

藥物特殊安全性試驗是注射劑臨床前安全性評價的重要組成部分，主要由體外溶血性試驗、過敏性試驗、局部刺激性試驗等組成。任何一項試驗結(jié)果出現(xiàn)陽性，則表明該藥安全性評價不符合標(biāo)準(zhǔn)，不宜用于注射途徑給藥。國外對于加米霉素注射液特殊安全性的公開文獻(xiàn)較少。但ZACTRAN在歐洲獸用藥品委員會提交注冊的評估報告[12-14]顯示，在3只兔子的皮膚刺激性試驗中，加米霉素會對皮膚造成輕微刺激，與本試驗結(jié)果有差異。分析原因為試驗用注射液在制備過程中采用了包膜緩釋技術(shù)，改變藥物釋放過程，降低皮膚刺激度。同時本實驗結(jié)果在藥物的Ⅱ、Ⅲ期靶動物臨床試驗中得到驗證，在牛、豬注射部位均未出現(xiàn)水腫等刺激反應(yīng)。歐盟[12-14]及FDA[15-16]根據(jù)靶動物牛、豬的安全性試驗判定，加米霉素注射液以6 mg/kg體重劑量注射安全可行。

溫育15 min 溫育3 h圖4 新西蘭大白兔紅細(xì)胞溶血性結(jié)果Fig 4 Result of New Zealand white rabbits red blood cell hemolysis

本研究通過大白兔、豚鼠的皮膚致敏、皮膚刺激、局部刺激、紅細(xì)胞溶血試驗表明，加米霉素注射劑無皮膚刺激性、不出現(xiàn)過敏反應(yīng) (致敏率為0)、無肌肉刺激性、無溶血和凝聚作用，臨床上可以肌肉注射使用。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物廣泛應(yīng)用于人及動物臨床，如泰拉霉素[17-18]、紅霉素、阿奇霉素和替米考星等，具有優(yōu)良的抗菌抗炎作用[19-20]。加米霉素注射液作為新一代動物專用藥品，它的特殊安全性研究及使用推廣在保障食品安全、降低人用抗生素耐藥性上有重要意義。加米霉素注射液屬化學(xué)藥品二類新獸藥，特殊安全性試驗為新藥注冊的重要組成部分，2017年2月原研單位梅里亞有限公司已在我國進(jìn)口注冊該品種，本試驗的研究對于搶占國內(nèi)市場具有重要支持作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] EMA,2008.Scientific Discussion[EB/OL].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scientific_Discussion/veterinary/000129/WC500068716.pdf,2008-05-04.

[2] Mitchell J D，Goh S，Mckellar Q A，etal. In vitro pharmacodynamics of gamithromycin against mycoplasma mycoides subspecies mycoides small colony[J].Vet J,2013,197(3)：806-811.

[3] Berghaus L J,Giguere S,Sturgill T L,etal. Plasma pharmacokinetics,pulmonary disttrbution,and in vitro activity of gamithromycin in foals[J].J Vet Pharmacol Ther,2012,35(1):59-66.

[4] Wyns H, Meyer E，Plessers E,etal. Pharmacokinetics of gamithromycin after intravenous and subcutaneous administration in pigs[J].Res Vet Sci，2014,96(1)：160-163.

[5] 馮克清. 加米霉素注射液在治療肉牛和非泌乳奶牛呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2016，50(8)：66-69.

Feng K Q. Progress of Gamithromycin Injection in the Treatment of Respiratory System Diseases for Beef and Non Lactating Dairy Cattle [J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2016, 50(8)：66-69.

[6] 羅顯陽. 加米霉素及其在牛呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2015，40(1)：12-15.

Luo X Y. Gamithromycin and its application in bovine respiratory diseases[J].Guangdong Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2015,40(1)：12-15

[7] 江志堯. 加米霉素及中間體的合成與抑菌活性研究[D].重慶：重慶大學(xué)，2010.

Jiang Z R. Study on the Synthesis and Antibacterial Activity of Gamithromycin and Intermediates[D]. Chongqing: Chongqing University, 2010.

[8] 向 蓉，楊大偉，岳 磊，等.獸用抗生素加米霉素研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42(16)：79-83.

Xiang R,Yang D W,Yue L,etal. Advance in Gamithromycin ：veterinary antibiotic[J].Cuang dong Agicultural Sciences, 2015，42(16)：79-83.

[9] 農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2497號[S].

Ministry of Agriculture.Ministry of Agriculture of the People 's Republic of China Notice No. 2497[S].

[10] 農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第442號[S].

Ministry of Agriculture.Ministry of Agriculture of the People 's Republic of China Notice No. 442[S].

[11] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則2014年版[S].

State Food and Drug Administration. Technical guidelines for drug irritation, allergic and hemolytic studies 2014 edition[S].

[12] EMA.European public MRL assessment report Gamithromycin (Bovine species)，EMEA/CVMP/567075/2008 [EB/OL].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Maximum_Residue_Limits_-_Report/2009/11/WC500014340.pdf,2009-07-16.

[13] EMA.CVMP assessment report for ZACTRAN for pigs，EMA/839749/2015[EB/OL].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Assessment_Report_-_Variation/veterinary/000129/WC500203786.pdf,2015-12-10.

[14] EMA.European public MRL assessment report Gamithromycin (porcine)，EMA/CVMP/350415/2014 [EB/OL].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Maximum_Residue_Limits_-_Report/2015/02/WC500183124.pdf,2015-02-23.

[15] FDA.Freedom of information summary original new animal drug application , Nada141-328，zactran，Gamithromycin Injectable Solution Beef and Non-Lactating Dairy Cattle [EB/OL]. http://www.fda.gov/downloads/animalveterinary/products/approved animal drug products/foiadrug summaries/ucm277806.pdf,2011-01-11.

[16] FDA.Freedom of information summary supplmental new animal drug application，Nada141-328，zactran，Gamithromycin Injectable Solution Beef and Non-Lactating Dairy Cattle[EB/OL].http://www.fda.gov/downloads/animalveterinary/products/approved animal drug products/foia drug summaries/ucm307838.pdf，2012-08-11.

[17] 周 磊,顏其貴，吳聰明.泰拉霉素和紅霉素對一氧化氮和前列腺e2合成抑制作用的比較[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(9)：1939-1947.

Zhou L,Yan Q G,Wu C M.InvitroInhibitory Effects of Tulathromycin and Erythromycin on the Productions of NO and PGE2[J].Scientia Agricultura Sinica, 2010，43(9)：1939-1947.

[18] 趙永達(dá)，劉帥帥，焦曉軍，等.泰拉霉素注射液在豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)及生物利用度研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(4)：823-828.

Zhao Y D,Liu S S,Jiao X J,etal. Pharmacokinetic and Bioavailability Study of Tulathromycin in Swine[J].Scientia Agricultura Sinica, 2011，44(4)：823-828.

[19] Banjanac M,Munic K V,Nujic K,etal. Antiinflammatory mechanism of action of azithromycin in LPSstimulated J774A.1 cells[J].Pharmacol Res,2012,66(4)：357-362.

[20] Ci X,Chu X,Xiang H,etal. Antiinflammatory effects of tilmicosin in a noninfectious mouse model of allergic asthma[J].Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33(4)：626-632.