外周血胎兒游離DNA檢測在無創性產前診斷中的價值

吳玥麗 張琳琳 趙 玲 朱重陽 李 琳 李 瑩

河南省婦幼保健院(鄭州大學第三附屬醫院)(鄭州，450052)

染色體非整倍體是妊娠早中期常見的染色體異常，胎兒非整倍體是新生兒出生缺陷、圍產期胎兒死亡的主要原因。產前篩查是降低染色體異常兒出生行之有效的手段。羊水染色體核型分析診斷胎兒非整倍體準確率較高，達98%～99%[1]，是診斷胎兒染色體非整倍的金標準，但是該方法屬于有創性操作，可增加術后流產、羊水滲漏、宮內感染等風險，發生率達0.3%～1.0%[2]，且不適用于有羊水穿刺禁忌孕婦。因此無創產前檢測成為胎兒染色體異常篩查的研究方向，而傳統無創性篩查的假陽性率達5%～8%[3]。孕婦外周血胎兒游離 DNA 無創產前檢測是對高通量大規模基因組測序，大大提高了準確率，其檢查敏感性、特異性可達99%，假陽性率為0.1%[4]。本研究回顧性分析了本院行外周血胎兒游離DNA無創性產前檢測及羊水穿刺胎兒染色體核型分析的孕婦資料，探討其檢測診斷胎兒非整倍體染色體的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入對象均為產前診斷的適應對象，孕婦年齡≥35歲；唐氏征篩查高風險；不良妊娠史；孕早期服用致畸藥物；孕育染色體異常胎兒病史；染色體異常家族史；羊水過多或過少；B 超提示胎兒異常。排除標準：資料缺失；正常妊娠孕婦。依據以上標準選擇2017年1月—2017年12月于本院行外周血胎兒游離DNA無創性產前檢測和羊水穿刺胎兒染色體核型分析的孕婦616例，年齡(38.0±2.1)歲(35～39歲)，孕周(20.4±5.2)周(12～24周)。

1.2 DNA檢測

采集孕婦外周血 10 ml 于EDTA 抗凝管充分混勻中，4℃條件下分離血漿提取DNA，紫外分光光度法鑒定DNA純度和完整性，運用高通量基因檢測技術進行DNA測序。三體高風險診斷標準：Z=(待測染色體的比例-總體人群的比率)/對照組待測染色體方差，Z≥3為三體高危，Z≤3為單體高危。

1.3 染色體核型分析

常規消毒，超聲引導下經腹壁穿刺子宮至羊膜腔抽取羊水20 ml離心取沉淀物加入羊水培養瓶，置37℃、5% CO2培養箱8～12d，適當更換培養液;觀察羊水細胞生長良好，加入秋水仙素，經37℃低滲、固定、制片、G顯帶、染色處理，進行計數和染色體核型分析。采用徠卡GSL-120掃描系統采集分裂相,CytoVision軟件分析數據,核型描述按照ISCN2016進行描述。

1.4 統計學分析

設a為真陽性數，b為假陽性數，c為假陰性數，d為真陰性數，敏感性=a/(a+c)，特異性=d/(b+d)，陽性預測值=a/(a+b)，陰性預測值=d/(c+d)。SPSS22.0進行數據分析，ROC分析胎兒游離 DNA無創性產前檢測診斷胎兒非整倍體的效能。P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DNA無創性產前檢測與羊水染色體核型分析

DNA無創性產前檢測共檢出胎兒染色體非整倍高風險11例，其中 21-三體高風險(47,XN,+21)5例，18-三體高風險(47,XN,+18)3例，13-三體高風險(47,XN,+13)1例；羊水染色體核型分析檢出染色體非整倍體12例，其中21-三體5例，18-三體3例，13-三體1例，符合率100%。此外，DNA無創性產前檢測性染色體非整倍體(47,XXY/47,XXX)2 例，羊水染色體核型分析結果3例，符合率66.67%；總體符合率91.67%。

2.2 DNA無創性產前檢測診斷胎兒非整倍體效能

以羊水染色體核型分析結果為金標準，游離 DNA無創性產前檢測胎兒非整倍體的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為91.7%、100.0%、100.0%、99.8%、99.8%、95.0%，ROC分析其曲線下面積為0.958(95%CI：0.867～1.000)，見圖1。

圖1 胎兒游離DNA無創性產前檢測診斷胎兒非整倍體的ROC圖

3 討論

我國每年新生兒為出生缺陷兒中10%為遺傳因素導致[5]，而染色體異常新生兒中95%為非整倍體異常[6]，產前篩查是降低染色體異常胎兒的主要措施。醫學界一直在尋找一種無創獲得胎兒DNA的方法。母體外周循環血中胎兒細胞數目十分微量，如何有效提取胎兒細胞成為無創檢測胎兒DNA的關鍵，游離胎兒 DNA 片段的發現[7]，促進了無創性產前檢測突飛猛進的發展。Dan等[8]采用高通量測序技術檢測來自母體血漿中的胎兒游離DNA片段，檢測染色體異常與有創檢測結果符合率達100.0%。近年來，國內也開展了大量無創檢測胎兒DNA的研究，均取得了較高的檢測準確率[9]。

本研究采用高通量測序技術檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA片段，與羊水染色體核型分析結果比較，胎兒染色體非整倍與核型分析符合率100.0%。從診斷效能來看曲線下面積達0.883，靈敏度和特異度達88.0%、82.6%，驗證了該技術的臨床價值。表明，孕婦外周血胎兒游離DNA檢測可有效檢測胎兒染色體非整倍體異常。DNA無創性產前檢測性染色體非整倍體與羊水染色體核型分析符合率66.7%,總體符合率達91.7%。無創檢測技術對性染色體異常的檢測效能較低，可能與孕婦游離 DNA 含量有關；或與孕婦性染色體異常嵌合體或局限性胎盤嵌合體有關，因為孕婦本人為性染色體異常嵌合體或存在局限性胎盤嵌合體會造成測試結果不準確[10]。

無創產前檢測技術也存在一定的局限性：無法完全區分母體來源DNA片段與胎兒游離DNA片段；由于檢測到的胎兒游離DNA片段來自母體胎盤滋養層脫落細胞，該細胞在母體外周血中含量極少，使檢測結果受取材質量的限制較大[11]；由于胎兒游離DNA來自滋養層細胞，如果存在局限性胎盤嵌合，滋養層細胞異常，而胎兒正常，由此導致檢測結果假陽性；該方法檢測的是胎盤滋養層DNA，在無法有效區分胎兒DNA 和母體 DNA情況下，難以根據DNA基因測序結果推斷染色體非整倍體[12]。因此，臨床診斷非整倍體胎兒仍需要結合多項檢測結果做出最終判斷，不能僅依賴單一的檢測手段。

綜上，無創性胎兒游離DNA檢測可有效檢出胎兒染色體非整倍體，實現了通過分析母體血樣診斷胎兒情況的無創檢測，為臨床診斷提供了多種選擇的可能，是一種可靠的產前檢測方法，但不排除存在假陽性及假陰性的可能。