G族黃曲霉毒素半抗原分子設計、抗原合成及抗體特性

王亞楠,王曉斐,牛琳琳,雷 壯,張海棠,王自良(.河南科技學院 動物科技學院，河南新鄉 453003；.河南科技學院 新科學院，河南新鄉 453003)

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)對機體具有急性、慢性、致癌和免疫抑制等毒性作用，其中以AFB1毒性最強，污染廣泛，比例最高(占 50% 以上)。世界上大多數國家對食品中 AFB1最大殘留限量(Maximum residue limit，MRL)都做出明確規定[1-2]。自然條件下產生的 AF 主要包括 B1、B2、G1、G24 種，其污染食品的特點是多種毒素幾乎同時存在，且具有毒性加性效應，制訂 AF 總量(Total aflatoxins，TAFs)(B1+B2+G1+G2)的 MRL 及相應檢測方法已成為發展趨勢[3]。至 2013 年，世界上已有 91 個國家采用TAFs限量標準，如國際食品法典委員會(CAC)、美國食品與藥物監督管理局(FDA)等規定食品中 TAFs 限量標準為 15 μg·kg-1，日本為 10 μg·kg-1，歐盟為 4 μg·kg-1，中國現有標準尚未涉及 TAFs 限量要求，但在《GB/T 5009.23-2006 食品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的測定》標準中規定了 TAFs 限量的檢測方法[4]。

食品中TAFs分析方法主要有理化分析和免疫分析兩類，其中免疫分析方法由于具有選擇性強、靈敏度高、快速簡便、樣品篩檢量大、可現場操作等優勢，已成為TAFs檢測研究的熱點課題，并在TAFs快速檢測中發揮重要作用[5]。高質量的抗體是建立免疫分析方法的核心試劑，就目前的研究進展而言，實現TAFs免疫分析的主要途徑之一是分別制備針對B族AF和G族AF的靈敏度高、特異性強的單一抗體，之后形成混合通用抗體，而高質量抗體的制備依賴于半抗原分子設計與抗原合成[6]。關于G族AF抗原合成方法的研究國內外已有相關報道，但對不同半抗原分子設計、抗原合成及抗體特性比較分析方面的研究尚未見報道。本研究以AFG1為反應起始原料，旨在通過不同AFG1半抗原分子設計與抗原合成方法合成人工抗原，制備多克隆抗體(pAb)，并對其特性進行分析，篩選出最佳半抗原分子設計與抗原合成方法，為特異性強、親和力高、識別譜廣的G族AF高質量抗體的制備和TAFs免疫分析方法的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑 AFB1、B2、G1、G2標準品，德國Prio-Lab公司產品，購自鄭州市盈科試劑耗材經營部；牛血清白蛋白 (BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)，Pierce公司產品，購自鄭州市中原區云科試劑耗材站；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體(GaRIgG-HRP)，華美生物工程有限公司產品。其他試劑市售所得，均為分析純或色譜純。試驗用水均為三蒸水。

1.1.2 溶液 ELISA所用稀釋液為0.01 mol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；洗液為含0.5 g·L-1Tween-20(PBST)的PBS；封閉液為含50 g·L-1豬血清的PBST；包被液為0.1 mol·L-1pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)。

1.1.3 主要儀器 Pharmacia蛋白質核酸分析儀，Amersham公司；WD-9403D型紫外儀，北京六一儀器廠；RF-5301 PC熒光光譜儀，日本島津公司；JY-3000電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本日立公司；多功能全自動酶標儀(MK3型)，美國熱電公司。

1.1.4 試驗動物 SPF級4周齡雌性Balb/C小鼠，新鄉醫學院實驗動物中心提供，動物許可號：SCXK(豫)2010-0002。

1.2 方 法

1.2.1 G族AF半抗原分子設計與人工抗原合成 以AFG1為起始原料，根據其分子結構上存在的活性基團和活性位點(圖1)，參照文獻[7-11]，采用半縮醛法(semi acetal，SA)、環氧化物法(Epoxide，EP)、烯醇醚衍生物法(Enol ether derivative，EED)合成AFG1-BSA。

1、2、3、4表示活性位點 1,2,3 and 4 indicates active sites

圖1AFG1分子結構式

Fig.1MolecularstructureofAFG1

SA法：AFG1在H2SO4作用下轉化為AFG2a，AFG2a的醛基與BSA的氨基生成不穩定的希夫氏堿，在NaBH4的還原作用下，生成穩定的AFG2a-BSA[7-8]，合成路線見圖2。

圖2 AFG1-BSA SA法合成路線

EP法：利用AFG1雙呋喃環雙鍵，在氧化作用下， AFG1的3位、4位形成環氧化物，與BSA的-NH2反應形成二級胺，以-CONH-形式與BSA偶聯合成AFG1-BSA[9-10]，合成路線見圖3。

EED法：利用AFG14位的活性位點，通過添加乙醇酸連接臂，得到AFG1烯醇醚衍生物(AFG1-GA)，利用AFG1-GA的羧基與BSA偶聯合成AFG1-BSA[11]，合成路線見圖4。

1.2.2 G族AF人工抗原鑒定 UV鑒定：稱取一定量的AFG1、BSA和AFG1-BSA，AFG1用甲醇溶解，以甲醇作空白對照；BSA和AFG1-BSA用甲醇PBS溶液[V(甲醇)∶V(PBS)=4∶6)]溶解，為空白對照，在波長200～450 nm進行紫外掃描，分析掃描圖譜，參照文獻[12-13]所述方法計算AFG1與BSA的分子結合比。

SDS-PAGE鑒定：濃縮膠質量濃度為50 g·L-1，電壓90 V；分離膠質量濃度為120 g·L-1，電壓45 V；上樣量每孔10 μL，蛋白每孔10 μg；考馬斯亮藍染色，用紫外凝膠成像系統分析軟件計算AFB1與BSA的分子結合比。

熒光強度鑒定：稱取一定量的BSA和AFG1-BSA溶解于甲醇PBS溶液[V(甲醇)∶V(PBS)=4∶6)]，質量濃度均為1.0 mg·mL-1，在激發波長365 nm、發射波長440 nm的條件下測定熒光強度。

圖3 AFG1-BSA EX法合成路線

圖4 AFG1-BSA EED法合成路線

1.2.3 AFG1pAb制備與免疫學特性分析 AFG1pAb制備：用3種不同方法合成的抗原AFG1-BSA分別免疫Balb/C小鼠，每種抗原免疫1組，共3組，每組5只。免疫劑量按AFG1-BSA中BSA的量計算，每只50 μg，體積為0.2 mL，背部皮下4～6點注射，共免疫5次，時間間隔4 d。最后1次免疫后21 d摘除眼球眶下竇采血，分離血清，得到AFG1pAb。

AFB1pAb免疫學特性分析：采用間接ELISA進行效價檢測[14]。敏感性鑒定，間接競爭ELISA(icELISA)測定AFG1pAb對AFG1的50%抑制質量濃度(IC50)，以IC50衡量敏感性[15]。特異性鑒定，采用交叉反應試驗，選擇AFG1、G2、B1、B2作為抑制物，icELISA測定各抑制物的IC50，以AFG1pAb對AFG1的IC50與AFG2、B1、B2的IC50百分比為其交叉反應率(CR)。

2 結果與分析

2.1 G族AF人工抗原鑒定

2.1.1 UV鑒定 由圖5可知，BSA的最大吸收峰在278 nm，AFG1在200～500 nm有243、257、264和362 nm 4個吸收峰，最大吸收峰在362 nm。SA和EP均在346 nm和413 nm出現特征吸收峰， EED在423 nm出現特征吸收峰，與BSA和AFG1有不同的紫外吸收特征，表明采用3種方法均成功合成人工抗原AFG1-BSA。AFG1與BSA的分子結合比見表1。

圖5 合成人工抗原AFG1-BSA的紫外光譜圖

表1 不同偶聯方法合成AGB1-BSA的分子結合比

注：由于BSA的相對分子質量為66 200，AFG1為328，BSA遠大于AFG1，因而在計算利用率時，設定BSA被100%利用。

Note:Due to relative molecular mass of BSA is 66 200,AFG1is 328,the relative molecular mass of BSA is much larger than that of AFB1,so in the calculation of usage ratio of BSA,set BSA to be used by 100%.

2.1.2 SDS-PAGE鑒定 由圖6可知，3種方法合成的免疫原AFG1-BSA在凝膠板上的遷移速率小于BSA，表明AFG1-BSA的MW大于BSA，說明AFG1-BSA合成成功。

2.1.3 熒光強度鑒定 由圖7可知，在相同激發光源、相同蛋白質質量濃度(1.0 mg·mL-1)條件下，3種方法合成的抗原與BSA相比，熒光強度均有不同程度增強，表明完全抗原合成成功。

1.Maker；2.BSA；3.SA；4.EP；5.EED

2.2 AFG1 pAb免疫學特性分析

2.2.1 效價測定 由圖8可知，經5次免疫后，每組挑選出1只效價最高的小鼠，共挑選出3只，間接ELISA測定其效價，并進行比較，3只小鼠的AFG1pAb效價均達到1∶(1.6×103)以上，說明合成的3種完全抗原AFG1-BSA均具有很好的免疫原性，按效價評價3組的免疫效果，順序依次為SA、EP和EED。

圖7 合成人工抗原AFG1-BSA的熒光強度

2.2.2 敏感性分析 由圖9可知，免疫后挑選出效價最高的3只小鼠的阻斷ELISA曲線呈良好的線性關系，將A450nm值轉化為B/B0%，再對lg[AFG1/100]進行回歸分析，均符合線性關系的判定標準。該 3 只小鼠血清AFG1pAb抑制曲線的回歸方程、R2值和IC50值見表2，其中抑制效果最好的是SA 組小鼠的血清，IC50為13.6 μg·kg-1，其次是EP組(20.28 μg·kg-1)， EED組小鼠的敏感性較差。

2.2.3 特異性分析 由表3可知，3種偶聯方法

圖8 AFG1 pAb效價測定曲線

合成抗原免疫動物后獲得的AFG1pAb均能100%識別AFG1，其中AFG1pAb(SA)敏感性最好，IC50為13.6 μg·kg-1，廣譜性也最好，與AFG2的CR為82.19%，與AFB1、B2的CR均小于10%。AFG1pAb(EP)具有較好的敏感性，IC50為20.28 μg·kg-1，但廣譜性較差，與其他AF的CR均小于10%。AFG1pAb(EED)對AFG1的敏感性較差，IC50為65.32 μg·kg-1。結果表明，半縮醛法制備的AFG1-BSA敏感性高、特異性強、廣譜性最好。

3 討 論

3.1 AF人工抗原合成路徑

高質量的抗體是建立免疫分析方法的核心試劑，就目前的研究進展而言，實現TAFs總量免疫分析的途徑有兩條，一是分別制備B族AFs和G族AFs靈敏度高、特異性強的單一抗體，之后混合為混合通用抗體，該方法目前較為常用，并取得很好的應用效果；二是制備能夠同時識別AF B1、B2、G1、G2且靈敏度高、識別譜廣的單一通用抗體，這是最為理想的技術方法，但制備這種高質量的單抗較為困難。由于AF是小分子半抗原，必須合成人工免疫原，借助活化的T細胞輔助B細胞增殖及分化，從而獲得合格的抗體。

圖9 AFG1 pAb對AFG1的抑制曲線

表2 AFB1 pAb對AFB1抑制曲線的回歸方程、R2值和IC50值

注：“y”表示抑制率，即不同質量濃度AFG1標準品溶液A450值與空白溶液A450值的百分率；“x”表示不同質量濃度AFG1標準品溶液的常用對數值。

Note: “y”indicates the inhibition percentage, that is the percentage of A450value of AFG1standard solution with different mass concentration and A450value of blank solution；“x” indicates the common logarithm value of AFG1standard solution with different mass concentration.

表3 AFG1 pAb與AFB1、B2、G1、G2的交叉反應

3.2 G族AF人工免疫原合成方法及免疫效果

由于對G族AF半抗原分子設計、抗原合成方法及所產生抗體特性的研究起步較晚，綜合分析上述3種方法，筆者認為，半縮醛法效果最優，將AFG1酸化形成AFG2a，利用AFG2a的3位羥基活性基團，以希夫氏堿為間隔臂合成抗原，所產生抗體具有效價高、敏感性好、特異性強和識別譜廣的特性。環氧化物法可以誘導機體快速產生抗體，但其敏感性方面不及半縮醛法。烯醇醚衍生物法存在明顯的缺陷，誘導機體產生抗體的能力較差，且產生的抗體對AFG1的敏感性較差，因此，該方法在科學研究中具有較好的應用價值，但實際生產中應用很少。

3.3 AF人工免疫原合成方法的發展趨勢

由于 AFB1與其他 AF 污染密切相關，AFB2污染伴隨AFB1，高濃度AFB1對AFG1和AFG2有抑制作用，因此，對于食品AF污染免疫檢測評價方法有兩種，包括中國在內部分國家采用AFB1限量標準，但為解決多種毒素污染同時存在且具有毒性疊加效應及在檢測標準方面的相應缺失，部分國家采用AF總量(B1+B2+G1+G2)限量標準。鑒于此，AF免疫分析技術的研究重點在于通過AF半抗原分子設計與抗原合成，一方面提高抗體對AFB1識別的敏感性和特異性，滿足對AFB1限量標準的要求；另一方面，提高抗體對AFB1、AFB2、AFG1、AFG2識別的敏感性和廣譜性，滿足對AF總量限量標準的要求。目前，AF半抗原分子設計與抗原合成仍停留在經驗設計與預測設計層面，多采用試錯法(Trial-and-error assays)進行，盡管對合成的人工抗原已建立紅外(IR)、紫外(UV)、質譜(MS)、凝膠電泳(SDS-PAGE)和核磁共振(NMR)等多種鑒定方法，但最終是需通過動物試驗驗證其科學性和合理性，一定程度上存在盲目性和偶然性[16]。隨著分子免疫學、量子化學、分子力學等新型學科的興起，分子信息技術、分子模擬技術、計算機輔助技術的推廣應用，這些為提高半抗原分子設計與抗原合成的合理性、時效性和預見性提供可供借鑒的理論與方法[17-19]。Kim等[20]通過計算機輔助技術，制備出特異性強、識別譜廣的TAFs mAb，對AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的IC50分別為4.36、7.22、6.61、29.41 μg·kg-1，以ELISA技術模式實現TAFs檢測。周茜等[21]借助分子模擬技術，成功制備G族AF mAb，對AFG1、AFG2的IC50分別為17.18、19.75 μg·kg-1，并建立AF G族ELISA檢測方法。

4 結 論

根據AFG1的分子結構和活性位點，采用SA法、EP法和EED法3種方法制備G族AF人工免疫原AFG1-BSA，通過UV、SDS-PAGE和熒光強度測定對合成的人工抗原進行鑒定。結果表明，在G族AF人工免疫原合成的3種方法中，SA法效果最好，AFG1與BSA的分子結合比為4.32∶1，動物免疫所產生的AFG1pAb具有效價高、敏感、特異、廣譜等特性。研究結果為G族AF和AF總量免疫檢測方法的建立奠定基礎。

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