響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波-酶法提取紫色花椰菜原花青素

◎ 崔晶蕾，劉振春，彭 雪，張 悅，周瑾琨

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

紫色花椰菜，又名紫色花菜、紫色椰花菜、紫色甘藍(lán)花、紫色洋花菜、紫色球花甘藍(lán)[1]，屬十字花科蕓薹屬植物，原產(chǎn)于歐洲地中海沿岸一帶，2014年在臺灣上市，紫色花椰菜可食性部位為花球部，依據(jù)新鮮程度不同，花球呈現(xiàn)的顏色也不同，常見的顏色有深紫紅色和淺紫紅色兩種，葉片深綠色，主根呈綠色夾雜紫色[2]。紫色花椰菜營養(yǎng)價值極為豐富，富含豐富的原花青素及維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素C，其蛋白質(zhì)和鉀的含量極高，其中蛋白質(zhì)高達(dá)3%左右，鉀含量更是達(dá)到富鉀蔬菜等級，紫色花椰菜的含鉀量和香蕉等水果相當(dāng)，被人們譽為“高蛋白高鉀蔬菜”。由于它不像芹菜一般有著大量的粗纖維，紫色花椰菜花球細(xì)密，質(zhì)地柔嫩，所以口感極佳[3]。紫色花椰菜口味和花椰菜類似，風(fēng)味鮮美，常見的食用方法為炒制、白灼、燉煮等。

目前，對原花青素的提取研究較為廣泛和全面，最早期的提取原花青素的方法是溶劑提取法，選用的溶劑也是最安全的水，原料基本上為松樹皮、葡萄籽、藍(lán)莓果渣等。隨后人們發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)纳郎亍⒓訅骸⒚撗鯚崴确椒ㄝ^常規(guī)的常溫下用水提取效果明顯好很多。隨著逐步的發(fā)展，又考慮到用有機溶劑、有機酸等提取，還有一些處理方法也能加速原花青素的提取效率，例如超聲波輔助提取法[4]、微波輔助提取法[5]、超聲波微波聯(lián)用[6]、超臨界CO2提取法[7]、酶法[8]等。還有依據(jù)提取物性質(zhì)的不同，加入纖維素酶制劑，促進(jìn)植物細(xì)胞壁裂解，使原花青素提取物加速流出[9]。

目前，原花青素的測定方法也有很多且技術(shù)較為成熟，常見的測定原花青素含量的方法有正丁醇-鹽酸法[10]、香草醛-鹽酸法[11]、香草醛-硫酸法[12]、高效液相色譜法等[13]，考慮到測定精度、測定結(jié)果的穩(wěn)定性、操作簡便及成本等因素，本試驗采用低濃度香草醛鹽酸法測定紫色花椰菜中原花青素的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色花椰菜：市售，產(chǎn)地上海；紫色花椰菜清洗后瀝干水分，經(jīng)過挑選、除雜、切碎、烘干、粉碎，過60目篩后備用。原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%，天津一方科技有限公司；香蘭素：純度≥99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶：酶活性≥150 U/mg，上海惠世生化試劑有限公司；甲醇、無水乙醇、鹽酸、冰醋酸、乙酸鈉：均為分析純，北京化工廠。

101A-3ET電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、RZ102微型植物粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、SHA-B水浴恒溫振蕩箱（金壇市江南儀器廠）、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠）、LXJ-ⅡB低速大容量離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、AUY220電子天平（上海精天電子儀器有限公司）、TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、JY99-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海笠化儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫色花椰菜原花青素的提取方法

準(zhǔn)確稱取紫花菜粉末1.000 0 g置于100 mL小燒杯中，加入20 mL提前配制好的pH為5的HAc-NaAc緩沖溶液，向料液中加入一定質(zhì)量的纖維素酶，在一定溫度下水浴振蕩酶解，然后在一定超聲功率下進(jìn)行一定時間的超聲波提取后，分離上清液，將過濾后的濾渣中加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，在相同功率下提取20 min，保存濾液。再次將濾渣中加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，超聲提取10 min，合并所有濾液并過濾。將收集的所有濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮至恒重，旋蒸溫度為40 ℃，所得到的即為原花青素濃縮液。用甲醇將其定容至50 mL容量瓶中，在3 000 r/min下離心20 min，移取1 mL的上層清液保溫比色測定吸光度，并通過原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取物濃度，記錄并處理實驗數(shù)據(jù)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制溶液濃度為0.2 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1、2、3、4 mL和5 mL配制好的標(biāo)液用甲醇定容至10 mL，震蕩均勻后，各取1 mL（另取1 mL甲醇為空白）放置于試管中分別編號記錄，各加入5 mL顯色劑（A：2%香草醛-甲醇溶液和B：8%鹽酸-甲醇溶液，1∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配），搖勻，避光，在恒溫水浴鍋中保持35 min，溫度控制在（30±1）℃，保溫比色，取出比色皿，在500 nm處測其吸光度，分別平行測定3組，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。以原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X（×0.2 mg/mL）對吸光度Y進(jìn)行直線回歸，得回歸方程：Y=0.02X-0.0041，R2=0.999 2。

1.2.3 紫色花椰菜中原花青素提取率的計算

1.2.4 試驗設(shè)計

（1）單因素試驗。以原花青素的提取率為指標(biāo)，超聲波-酶法作為提取方法，準(zhǔn)確稱取紫色花椰菜粉末1.000 0 g，分別選擇加酶量、酶解溫度、酶解時間、超聲波功率和超聲時間5個因素作為影響紫色花椰菜原花青素提取的單因素，每組實驗平行重復(fù)3次，取平均值，分別記錄實驗數(shù)據(jù)。①加酶量。利用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將pH值調(diào)至為5，控制酶解溫度為40 ℃，酶解時間60 min，超聲時間30 min，超聲波功率為300 W，加 酶 量 為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%（以紫色花椰菜粉末質(zhì)量為基準(zhǔn)），分別測定不同加酶量下的紫色花椰菜原花青素提取率，確定最佳加酶量。②酶解溫度。利用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將pH值調(diào)至為5，加酶量2.0%，酶解時間60 min，超聲時間30 min，超聲波功率為300 W，酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃和65 ℃，分別測定不同酶解溫度下的紫色花椰菜原花青素提取率，確定最佳酶解溫度。③酶解時間。利用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將pH值調(diào)至為5，控制加酶量2.0%，酶解溫度為40 ℃，超聲時間30 min，超聲波功率為300 W，酶解時間為20、25、30、35、40 min和45 min，分別測定不同酶解時間下的紫色花椰菜原花青素提取率，確定最佳酶解時間。④超聲波功率。利用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將pH值調(diào)至為5，控制加酶量2.0%，酶解時間60 min，酶解溫度為40 ℃，超聲時間30 min，超聲功率為200、250、300、350、400 W和450 W，分別測定不同超聲波功率下的紫色花椰菜原花青素提取率，確定最佳超聲波功率。⑤超聲波時間。利用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將pH值調(diào)至為5，控制加酶量2.0%，酶解時間60 min，酶解溫度為40 ℃，超聲波功率為300 W，超聲波時間為10、15、20、25、30 min和35 min，分別測定不同超聲波時間下的紫色花椰菜原花青素提取率，確定最佳超聲時間。

（2）Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗。通過單因素試驗的結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理選取加酶量、超聲波功率、超聲波時間3個變量采用響應(yīng)面分析法對其進(jìn)行優(yōu)化，以原花青素提取率為考察值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗。試驗因素與水平見表1。

表1 超聲波-酶法輔助提取紫色花椰菜原花青素的響應(yīng)面分析水平及因素表

1.3 數(shù)據(jù)處理

選擇對紫色花椰菜原花青素提取率影響較大的加酶量、超聲波功率、超聲波時間3個因素進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用響應(yīng)面分析軟件design-expert8.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及其回歸方程

配制原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.2 mg/mL，選擇最大吸收波長。經(jīng)試驗，最大吸收波長為500 nm，用紫外分光光度計分別測定梯度濃度下原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，以原花青素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。可知，原花青素濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

圖1 原花青素溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素實驗

2.2.1 加酶量對紫色花椰菜原花青素提取率的影響

由圖2可知，加酶量增加，原花青素提取率逐漸增大，這是因為加酶量較低時，纖維素酶能夠全部參與反應(yīng)，處于酶反應(yīng)動力學(xué)初級階段[15]，所以隨著加酶量的增加，提取率增大且增大速率較快。當(dāng)加酶量再繼續(xù)增加時，原花青素提取率增加速度變緩慢，因為纖維素酶作用的底物的量是一定的，當(dāng)反應(yīng)完全，即底物被酶充分作用，被幾乎徹底分解，反而繼續(xù)增加酶的用量不會使原花青素釋放量增加[16]。因此，纖維素酶的加入量選取2%較為適宜。

圖2 加酶量對紫色花椰菜原花青素提取率的影響圖

2.2.2 酶解溫度對紫色花椰菜原花青素提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，原花青素提取率先升高后下降，在溫度50 ℃左右時，提取率最大，溫度繼續(xù)增加，原花青素提取率迅速降低，原因是高溫可使酶失活，溫度不斷升高影響了酶的活性，削弱了酶促反應(yīng)的進(jìn)行，故最佳酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對紫色花椰菜原花青素提取率的影響圖

2.2.3 酶解時間對紫色花椰菜原花青素提取率的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的增加，紫色花椰菜原花青素的提取率逐漸升高，原因是酶解時間20 min時未被纖維素酶水解的底物較多，反應(yīng)進(jìn)行不完全，但隨著時間增加，40 min后原花青素提取率不再明顯升高反而在45 min時略有下降，所以最佳酶解時間為40 min。

圖4 酶解時間對紫色花椰菜原花青素提取率的影響圖

2.2.4 超聲波功率對紫色花椰菜原花青素提取率的影響

由圖5可知，隨著超聲波功率的增加，提取率增大，當(dāng)超聲波功率為300 W時，原花青素提取率達(dá)到最大值13.27%。功率超過300 W并且繼續(xù)升高時，提取率呈略明顯的下降趨勢，主要是因為伴隨著功率的加大，溫度會逐漸上升，高溫導(dǎo)致紫花菜粉末糊化，變性的菜粉原花青素也受到損傷[17]，所以直接影響試驗結(jié)果，故最佳超聲波功率為300 W。

圖5 超聲波功率對紫色花椰菜原花青素提取率的影響圖

2.2.5 超聲波時間對紫色花椰菜原花青素提取率的影響

由圖6可知，在10～25 min期間，提取率隨時間增長而逐漸提高，主要是因為超聲時間延長，超聲波對底物的作用增強，加速目標(biāo)產(chǎn)物從底物中分離出來的速率。當(dāng)超聲時間超過25 min并繼續(xù)延長時，提取率由高逐漸降低。原因是由于過度的超聲處理，導(dǎo)致產(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[18]，進(jìn)而導(dǎo)致了提取率的降低。故最佳超聲時間為25 min。

圖6 超聲波時間對紫色花椰菜原花青素提取率的影響圖

2.3 利用超聲波-酶法對紫色花椰菜原花青素提取的響應(yīng)面設(shè)計實驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Box-Behnken對加酶量（X1）、超聲波功率（X2）、超聲波時間（X3）3個影響因素進(jìn)行三因素三水平的中心組合試驗設(shè)計，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 超聲波-酶法提取紫色花椰菜原花青素的響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果表

表3 超聲波-酶法提取紫色花椰菜原花青素回歸方程的方差分析表

2.3.2 回歸方程的建立

對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，利用Designexpert8.0。得到X1，X2，X3三因素對超聲波-酶法提取紫色花椰菜原花青素提取率的二次多項回歸方程：

由表3可知，回歸模型P＜0.0001，說明二次回歸方程模型差異極顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.912 1，校正決定系數(shù)=0.984 5，說明模型實際值與預(yù)測值擬合較好，失擬項P=5.10＞0.05，表明失擬不顯著，試驗誤差較小。因此該模型可以用于紫色花椰菜原花青素提取率的分析和檢測。

2.3.3 雙因素交互作用

（1）加酶量和超聲波功率的交互作用。由圖7的響應(yīng)面圖和等高線圖可知，隨著加酶量和超聲波功率的加大，原花青素的提取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，響應(yīng)曲面的坡度傾斜較大，說明這兩個因素的交互作用顯著[19]，當(dāng)加酶量在2%左右、超聲波功率為300 W左右時原花青素提取率較高。

圖7 加酶量和超聲波功率的交互作用對提取率的影響圖

（2）加酶量和超聲波時間的交互作用。由圖8可知，加酶量越大、超聲波時間越長，原花青素的提取率先增大后減小，響應(yīng)面圖的曲面坡度較為平緩，說明這兩者的交互效應(yīng)較為顯著，但沒有加酶量和超聲波功率的交互作用明顯。

圖8 加酶量和超聲波時間的交互作用對提取率的影響圖

（3）超聲波功率和超聲波時間的交互作用。由圖9等高線圖的形狀可知，圖形接近于圓形，超聲波功率與超聲波時間的交互作用對提取率的影響不顯著。從響應(yīng)面圖的曲線變化趨勢看，超聲波時間對原花青素提取率的影響大于超聲波功率。

圖9 超聲波功率和超聲波時間的交互作用對提取率的影響圖

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗證

利用Design Expert 8.0對回歸方程進(jìn)行分析可知，在加酶量為2.08%，超聲波功率為316.63 W，超聲波時間為25.86 min時，即為超聲波-酶法提取紫色花椰菜原花青素的最佳工藝條件，按照以上條件參數(shù)進(jìn)行3次平行試驗以驗證試驗結(jié)果，其提取率的實測值為14.36%。該值落在響應(yīng)值14.9877%的95%預(yù)測區(qū)間[14.231%，15.792%]內(nèi)，表明所建回歸模型可以較好地反映紫色花椰菜原花青素提取的最佳條件。

3 討論與結(jié)論

本試驗提取紫色花椰菜中原花青素，是通過超聲波與纖維素酶協(xié)同作用的方法，再利用 Box-Behnken響應(yīng)面法對提取條件的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳工藝條件：加酶量2.08%，超聲波功率316.63 W，超聲波時間25.86 min，此條件下的紫色花椰菜原花青素提取率為14.36%，與鮑曉亮等用超聲波協(xié)同微波方法提取相比（提取率2.411%），提取率得到較大程度的提升，而且加入纖維素酶使提取縮短了處理時間、節(jié)省了溶劑用量，綜上測試結(jié)果表明，超聲波協(xié)同纖維素酶法提取紫色花椰菜原花青素，是一種較為理想的提取原花青素的方法。

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