青島市售酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性研究

◎ 馮金曉，李明珠，馮 倩

（青島工學院食品工程學院，山東 青島 266300）

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，現(xiàn)已作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品以及藥品領(lǐng)域中[1-3]。但乳酸菌應(yīng)用所帶來的安全性問題已經(jīng)引起人們的注意，尤其是某些菌對抗生素的耐藥現(xiàn)象更具有潛在的危險性[4]。一般情況下，耐藥性的傳播主要發(fā)生在臨床相關(guān)的菌株中，但已有體內(nèi)實驗證明，在腸道正常菌之間、腸道正常菌與致病菌之間也存在耐藥基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[5-6]。因此研究不同發(fā)酵食品來源的乳酸菌耐藥性問題，對于乳酸菌在食品中的安全使用具有重要意義。本研究對青島市售酸奶中的乳酸菌進行分離與初步鑒定，并對其進行抗生素耐藥性研究，以期為市售酸奶中發(fā)酵乳酸菌的安全性使用提供試驗數(shù)據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青島市售酸奶：均購于青島膠州市寶龍大潤發(fā)超市，于4 ℃冷藏保存。

1.2 試驗設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器，Thermo Finnpipette移液槍，SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，DH4000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱，PHS-25型實驗室pH計，722N型分光光度計，LW100B光學顯微鏡。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，具體配方及配制方法參見文獻[7]。

1.3.2 樣品的稀釋

于超凈工作臺內(nèi)，用移液槍從酸奶樣品中吸取1 mL加入到含9 mL無菌生理鹽水的試管中，快速震蕩試管，使其呈1∶10的均勻稀釋液，同法繼續(xù)稀釋成10-2、10-3稀釋度稀釋液，按此操作依次制備成A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的樣品稀釋液，其中A～E為樣品編號。

1.3.3 乳酸菌分離純化與形態(tài)觀察

（1）初次分離。于超凈工作臺內(nèi)，將MRS培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，倒入標有A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的無菌平板中，待完全凝固后，分別用移液槍吸取A～E的樣品稀釋液100 μL置于MRS固體培養(yǎng)基平板上，并用涂布棒涂布均勻后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24、48、72 h，根據(jù)菌落的大小、顏色、光澤和透明程度等，對平板中生長的菌落進行形態(tài)觀察。

（2）多次分離純化。對以上觀察到的A、B、C、D、E 5種平板中的相同形態(tài)菌落和單一平板中不同形態(tài)的菌落在無菌條件下進行平板劃線分離。將劃線平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。重復(fù)上述操作直至每個平板上只有一種微生物。

（3）形態(tài)觀察。菌株染色采用革蘭氏染色法[7]，顯微鏡油鏡鏡檢，記錄觀察結(jié)果。

1.3.4 生理生化試驗

根據(jù)菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，參照《伯杰細菌鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗，包括過氧化氫酶測定試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、乙酰甲基甲醇試驗、產(chǎn)氣試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、乳酸定性檢測試驗[7-8]。

1.3.5 耐藥性試驗

利用紙片擴散法[9]對分離自A、B、C、D、E 5種酸奶中的乳酸菌進行卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、青霉素、四環(huán)素、氯霉素、頭孢唑林10種抗生素的耐藥性試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

2.1.1 初次分離

樣品經(jīng)梯度稀釋后，根據(jù)稀釋液濃度不同采用平板涂布法進行分離，37 ℃培養(yǎng)24 h后，在5種稀釋液平板中均生長出一種菌落形態(tài)相似的微生物，鑒于菌落形態(tài)相似的微生物可能也存在不同的生理生化性質(zhì)，所以將其分別編號1～5號；37 ℃培養(yǎng)48 h后，平板C中長有另外兩種菌落形態(tài)不同的微生物，編號為6號、7號；同樣條件下培養(yǎng)72 h后，在E稀釋液平板中又發(fā)現(xiàn)一種與前三種菌落形態(tài)不一致的微生物，編號為8號。觀察得到的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種菌落形態(tài)不同的微生物，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌落形態(tài)圖

2.1.2 多次分離純化

在無菌條件下，將上述疑似8種不同的微生物分別挑取后劃線接種到MRS培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后觀察到1～5號菌的菌落形態(tài)一致；培養(yǎng)48 h后，觀察到6號、7號分離純化平板中生長出另外兩種不同形態(tài)的菌落；培養(yǎng)72 h后，8號分離純化平板中也長出不同菌落形態(tài)的微生物。將這四種菌落形態(tài)不同的微生物經(jīng)三次分離純化后，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種不同的微生物分離純化產(chǎn)物。結(jié)果如圖2所示。

圖2 多次分離純化后的菌落形態(tài)圖

2.2 形態(tài)學觀察

2.2.1 菌落形態(tài)

對4種菌落從其顏色、透明度、濕潤度、光滑程度、邊緣整齊度以及培養(yǎng)基變化6個方面進行觀察，結(jié)果記錄如表1。

表1 四種菌的菌落形態(tài)表

2.2.2 菌種形態(tài)

4種菌革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果如圖3所示。

圖3 革蘭氏染色鏡檢圖

由圖3可知，Ⅰ號菌為短桿狀，Ⅱ號菌為長桿狀，Ⅲ號菌為成鏈的球狀菌，Ⅳ號菌為分散的球狀菌，革蘭氏染色后均呈紫色，故4種菌均為革蘭氏陽性菌[7]；I、Ⅱ號菌為桿菌，Ⅲ號菌為鏈球菌屬，Ⅳ號菌為單球菌屬。

2.3 生理生化試驗

對分離純化后的1～8號菌進行生理生化特征鑒定，結(jié)果如表2所示。

表2 八種菌的生理生化試驗結(jié)果表

由表2可知，8種菌均能利用葡萄糖及乳糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，過氧化氫酶試驗陰性，不液化明膠，不水解淀粉，且1～5號菌的生理生化特性相同。結(jié)合上述試驗結(jié)果并對比查詢《伯杰細菌鑒定手冊》，得出4種形態(tài)不同的微生物的初步鑒定結(jié)果為：Ⅰ號菌為保加利亞乳桿菌；Ⅱ號菌為雙歧桿菌；Ⅲ號菌為嗜熱鏈球菌，Ⅳ號為乳酸乳球菌。

2.4 耐藥性試驗

對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種乳酸菌進行了耐藥性試驗，10種抗生素藥敏紙片分別編號1～10，試驗現(xiàn)象以保加利亞乳桿菌為例，如圖4所示。

圖4 藥敏性試驗現(xiàn)象圖

耐藥性試驗的結(jié)果見表3。

表3 不同乳酸菌的耐藥性試驗結(jié)果表

參照藥物敏感性標準中抑菌圈直徑的判定標準[10]，可得出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種乳酸菌對10種抗生素的耐藥性結(jié)果，如表4所示。

表4 四種乳酸菌對十種抗生素的耐藥性結(jié)果表

由表4可知，相對于乳酸球菌屬而言，乳酸桿菌屬總體上對10種抗生素的耐藥性要強，乳酸乳球菌的耐藥性最弱，包括卡那霉素在內(nèi)的所有抗生素都能抑制它的生長。氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、頭孢唑啉對這4種乳酸菌有很強的抑制性；青霉素、慶大霉素、鏈霉素對這4種乳酸菌有較強的抑制性；環(huán)丙沙星、萬古霉素、卡那霉素對這4種乳酸菌的抑制性相對較弱。

3 結(jié)語

對青島市售酸奶中的菌種進行增殖培養(yǎng)，用平板劃線分離法分離純化出4種菌，根據(jù)其菌落特征觀察結(jié)果、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果及生理生化試驗結(jié)果，結(jié)合《伯杰細菌鑒定手冊》確定了這4種菌分別是保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸乳球菌。對4種菌進行卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等10種抗生素的耐藥性試驗，結(jié)果表明：4種菌對氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、頭孢唑啉普遍敏感，對青霉素、慶大霉素、鏈霉素部分敏感，對環(huán)丙沙星、萬古霉素、卡那霉素存在普遍耐藥性。

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