乳及乳制品中β-內酰胺酶快速檢測試劑盒的比較研究

◎ 張 威，姜連閣

（黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，黑龍江 哈爾濱 150088）

牛奶中抗生素殘留是我國乃至全球奶牛業普遍存在的問題。目前，多數奶牛畜牧場均在使用抗生素類藥物來治療奶牛疾病[1-2]，隨著抗生素類藥物被廣泛應用于養殖業，牛奶中抗生素殘留問題日趨受到國內外相關人士的正視，但就國內奶牛飼養的大環境而言，其實基本無法把牛奶做到完全“無抗”的程度，去除牛奶中殘留的β-內酰胺酶類抗生素，β-內酰胺酶（生鮮牛乳抗生素分解劑）可能添加到各類乳制品中而起到掩蔽抗生素的作用，但由于現階段并未知曉這一生物制劑的安全性危害評估，乳制品生產企業嚴禁在其生產過程中添加β-內酰胺酶這一物質。隨著公眾對于食品安全問題的關注度越來越高，我國已經將β-內酰胺酶列為用于乳及乳制品掩蔽抗生素的非食用違法添加物質[3]。

目前，乳制品中的β-內酰胺酶的檢測方法主要有理化法、免疫法、微生物法等，以及以免疫法為基礎研制出的快速檢測試劑盒法[4]。杯碟法是我國當前認可的針對牛奶制品的主要檢測方法，但實驗過程較繁瑣、周期較長；碘量法的靈敏度不高、重現性也較差；酸測定法的假陽性和假陰性問題較嚴重，一直找不到解決辦法；液相色譜法的樣品前處理過程繁瑣，所用儀器對實驗人員要求較高，檢測成本昂貴。相比之下，建立準確、快速、可靠的快速檢測試劑盒法，不需要對樣品進行復雜的前處理過程，操作過程簡便且直觀易懂。在實際檢驗檢測工作中，β-內酰胺酶檢測方法是否方便、快速、敏感、準確愈來愈受到各界關注。現有的研究中多數為單一方法的探討，而對于國內外快速檢測試劑盒的研究很少，文獻中并未報道過對于試劑盒的評價研究，日常工作中缺少適用于檢測大批量樣品的篩選依據。

本文選用Charm和華安麥科快速檢測試紙條分別進行牛奶中β-內酰胺酶殘留的檢測，并以杯碟法作為比較，對比其檢測結果，了解和探討各方法的特點及優缺點，為建立不同種類乳及乳制品中β-內酰胺酶的快速、準確、可靠的檢測方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗樣品為150份乳制品樣品。藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001，北京嘉世玉禾化工技術研究院；β-內酰胺酶標準品（3×106U/mL），中國食品藥品檢定研究院；氨芐青霉素標準品、舒巴坦標準品，Dr.Ehrenstorfer (Germany)；抗生素鑒定培養基Ⅱ，北京陸橋技術有限責任公司；牛津杯，深圳新拓撲生物科技有限公司；Charm試劑盒，中檢柏泰生物技術（北京）有限公司；β-內酰胺酶快速檢測試紙條，北京華安麥科生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

調制乳、滅菌乳等液體乳制品以原液檢測，奶粉樣品按1∶10的比例稀釋后檢測，酸奶樣品經離心后，取中層液體按1∶2的比例稀釋，pH調至6.0后檢測。

選取其中50批陰性樣品，分別添加β-內酰胺酶標準品（3×106U/mL）使其β-內酰胺酶終濃度為4 U/mL，以此制成的陽性樣品作為檢測假陰性率的樣本。

1.2.2 檢測方法

（1）杯碟法。按照國家指定方法衛生部《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法 杯碟法》進行，以抑菌圈差值在3 mm以上作為陽性判定標準。

（2）華安麥科β-內酰胺酶快速檢測試紙條。測定步驟及判定參照試劑盒使用說明進行。

（3）Charm Rosa β-內酰胺酶試劑盒。測定步驟及判定參照試劑盒使用說明進行。

1.3 評價方法及分析指標

以國家指定方法衛生部《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法 杯碟法》為參考基準方法，用其檢測的結果評價快檢試劑盒的靈敏度、特異性、符合率（與現有方法一致性分析）及Youden指數，快檢試劑盒定性方法的性能指標計算方式見表1，樣品情況為由基準方法檢驗得到的結果，其中靈敏度為參比陽性樣品的檢出率；特異性為參比陰性樣品的陰性率；符合率為快檢方法與參比方法檢測結果一致的樣品數與樣品總數之比；Youden指數由公式（1）計算得出。

表1 定性方法性能指標計算表

2 結果與分析

2.1 杯蝶法及快檢試劑盒法的檢測結果

從市場上購買不同品牌的液態乳和奶粉樣品，采用杯碟法和快速檢測法分別對購置的乳及乳制品進行檢測，采用杯碟法在檢出限濃度（4 U/mL）下測定（其中A加入10 μL氨芐青霉素、B加入10 μL氨芐青霉素+50 μL舒巴坦、C加入10 μL氨芐青霉素+50 μL β-內酰胺酶、D加入10 μL氨芐青霉素+50 μL β-內酰胺酶+50 μL舒巴坦），C與D抑菌圈差值三平行的均值為3.2 mm，樣品的C與D抑菌圈差值大于此值的均視為陽性。

本實驗室在國內外的多種品牌的β-內酰胺酶快速檢測試劑盒的對比研究中發現，華安麥科及Charm品牌與參比方法所測定結果有較高的一致性，因此本次試驗選用這兩個品牌進行進一步研究。通過兩種快速檢測試劑盒對50批參比檢出限水平陽性樣品的檢測結果可知，兩種快速檢測試劑盒均無假陰性樣品出現，假陰性率均為0，說明兩種快速檢測試劑盒均具有良好的靈敏度。

為進一步考察兩種快速檢測試劑盒的特異性及一致性評價，在實際操作過程中對150批乳制品進行大批量篩查，檢測結果顯示所測定的液態乳和奶粉樣品中陽性樣品12批，陰性樣品138批，結果見表2。在本實驗選擇的兩種快速檢測試劑盒中，Charm試劑盒與杯碟法得出的結果無明顯差別，假陽性率僅為2%，且其標稱檢出限水平與參比方法一致，均為4 U/mL，能滿足實際樣品檢測的需要，而華安麥科β-內酰胺酶快速檢測試紙條因其2～4 U/mL的檢出限則出現較多的陽性樣品，無法對假陽性率進行確證，但對于實際樣品的檢測有一定影響，并不利于大批量樣品測定的快速篩查工作。

表2 150批乳制品測定結果表

兩個品牌的β-內酰胺酶快檢試劑盒部分檢測結果如圖1、圖2所示。Charm檢測試劑盒T線若比C線深則為陽性（＋），圖1中13批陰性樣品測定結果均為陰性（－）；華安麥科快速檢測試紙條T線若比C線深則為陽性（＋），T線若未出現則為失效（×），圖2中18批陰性樣品測定結果出現4批失效（×）及兩批假陽性（＋）。測定過程中發現，Charm檢測試劑盒對樣品的測定穩定性較好，而華安麥科β-內酰胺酶快速檢測試紙條對于樣品的要求較高，常出現失效現象，需要重新測定驗證，因此綜上所述，選用Charm檢測試劑盒進行進一步定性方法性能指標的確證。

圖1 Charm試劑盒部分檢測結果圖

圖2 華安麥科β-內酰胺酶快速檢測試紙條部分檢測結果圖

2.2 定性方法性能指標的確證

相比于國產快速檢測試紙條，Charm試劑盒檢出限與國家標準一致，均為4 U/mL，且假陽性率僅為2%，在實際檢測中具備更高的實用性，因此選用Charm試劑盒的測定結果進行定性方法性能指標的分析，Charm試劑盒與參比方法的150批乳制品測定結果通過統計學處理，差異無統計學意義（卡方檢驗：x2=1.34，P＞0.05），根據評價方法，Charm試劑盒檢測β-內酰胺酶的靈敏度為100%，特異性為97.8%，其靈敏度及特異性均達到試劑盒快速篩查檢測要求；與國家指定方法的符合率（即相對準確度）為98%，Youden指數為0.978，說明Charm試劑盒與國家指定方法有較好的相關性和一致性，對于乳及乳制品的檢測能夠基本滿足大批量篩選的要求。

3 討論

國家指定方法杯碟法屬于微生物檢測方法，本方法對實驗操作者有較高要求，準備工作較多，耗時較長，對于實驗條件要求嚴格。

Charm β-內酰胺酶檢測試劑盒采用競爭性配體-受體免疫法，利用β-內酰胺酶可分解乳及乳制品中的β-內酰胺類抗生素的原理，通過快速測定與β-內酰胺酶反應后殘留的青霉素G含量，從而快速檢測乳及乳制品中β-內酰胺酶殘留量。此試劑盒可快速檢測到牛奶樣品中殘留的β-內酰胺酶，靈敏度高，標稱檢測限為4 U/mL，與國家指定方法杯碟法的要求一致，且檢出率無特異性差異，與國家指定方法的測定結果有較好的一致性，綜上所述，杯碟法和Charm檢測試劑盒法兩種檢測方法均可用于檢測牛奶中β-內酰胺酶含量，在實際檢測過程中，需要檢測大批量樣品時可根據實際情況選擇檢測方法，以近期食藥總局出臺的評價技術規范作為依據，填補了試劑盒評價的空白，提供了試劑盒法快速篩查的理論依據，可選用 Charm檢測試劑盒法作為快速、準確、可靠的檢測方法預先篩查大批量樣品，出現陽性樣品時需要采用杯蝶法進行進一步確證。

[1]梁 勇，李巧蘇.關于動物源食品安全性的思考[J].現代農業科技，2008（17）：295-296.

[2]買合木提·克衣木，宋迎春，買熱木尼沙·吾甫爾.無公害牛奶安全生產探析[J].現代農業科技，2009（3）：239-240.

[3]中華人民共和國衛生部.全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求[Z].2009.

[4]徐加勤，朱國紅.肺炎克雷伯菌AmpC酶和超光譜β-內酰胺酶的檢測及分析[J].實用醫學雜志，2008，24（10）：1817-1818.